(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210587601.1 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 中信湘雅 生殖与遗传专科医院有限 公司 地址 410000 湖南省长 沙市高新 开发区桐 梓坡西路5 67号 (72)发明人 谭跃球　蒙岚岚　涂超峰　何文斌　 袁诗敏　徐西林　谭琛　 (74)专利代理 机构 华进联合专利商标代理有限 公司 44224 专利代理师 王秉丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01)C40B 50/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测男性不孕不育的基因文库的构建方法 和试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种检测男性不孕不育的二代 测序基因文库的构建方法和试剂盒。 所述构建方 法包括： 获取样本的基因组DNA； 对所述基因组 DNA中的男性不孕不育基因进行扩增， 构建检测 男性不孕不育基因的文库； 所述男性不孕不育基 因选自123个基因中的一种或者多种。 本发明能 针对男性不孕不育的一个或者多个基因进行扩 增并构建检测文库， 该文库能够用于二代测序， 实现二代测序在男性不孕不育基因检测 中的应 用， 采用二代测序对男性不孕不育基因进行检 测， 优点包括： (1)通量高； (2)成本低； (3)效率 高； (4)测序深度高。 权利要求书1页 说明书21页 序列表51页 附图2页 CN 114958967 A 2022.08.30 CN 114958967 A 1.一种检测男性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法， 其特征在于， 所述构建方 法包括： 获取样本的基因 组DNA； 对所述基因组DNA中的男性不孕不育基因进行扩增， 构建检测男性不孕不育基因的文 库； 所述男性不孕不育基因包括非梗阻性无精子症/严重少精子症相关基因、 弱/畸形精子 症相关基因和少弱畸形精子症相关基因； 所述非梗阻性无精子症/严重少精子症相关基因选自如下基因中的一种或者多种： DMC1、 FKBP6、 MEI1、 MEIOB、 MAJIN、 MSH4、 MSH5、 RAD21L1、 RNF212、 SHOC1、 SIX6OS1、 SPATA22、 STAG3、 SYCE1、 SYCP3、 TERB1、 TERB2、 TEX11、 TEX15、 TOL6BL、 XRCC2、 ZSWIM7、 M1AP、 FBXO43、 RPL10L、 ZM YND15、 TDRD7、 TDRD9、 NR5A1、 TEX14、 US P26、 ANOS1、 S PINK2、 USP9Y和CEP128； 所述弱/畸形精子症相关基因选自如下基因中的一种或者多种： DNAH1、 DNAH2、 DNAH6、 DNAH17、 CFAP70、 CFAP43、 CFAP44、 CFAP251、 CFAP91、 SPEF2、 CFAP65、 FSIP2、 AKAP4、 CEP135、 DZIP1、 TTC21A、 TTC29、 CFAP69、 QRICH2、 AK7、 ARMC2、 CFAP47、 CFAP58、 DNAH8、 DNAH10、 CFAP206、 CATIP、 WDR63、 DNHD1、 SLO3、 DRC1、 STK33、 SUN5、 TSGA10、 PMFBP1、 DNAAF1、 DNAAF2、 DNAAF3、 DNAAF4、 DNAAF5、 DNAAF6、 ZMYND10、 LRRC6、 C11orf70、 TTC12、 DNAH5、 DNAH9、 DNAI1、 DNAI2、 CCDC39、 CCDC40、 GAS8、 RSPH1、 RSPH3、 RSPH4A、 RSPH9、 HYDIN、 DNAJB13、 GAS2L2、 DPY19L2、 CATSPER2、 ZPBP、 PICK1、 SPATA16、 BRDT、 SPAG1、 SLC26A8、 CATSPER1、 CCNO、 AURKC、 C21orf59、 C CDC151、 C CDC114、 GFPT2、 PATE1、 GAL NTL5、 IFT74、 WDR 1和ADCY10； 所述少弱畸形精子症相关基因选自如下基因中的一种或者多种： FANCM、 CDC14A、 KLHL10、 SEPTI N12、 SYCP2、 BRWD1、 CFAP61、 RABL2 A和KATNAL2。 2.根据权利要求1所述的检测男性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法， 其特征 在于， 所述样本取自特发性无精子症患者、 特发性严重少精子症患者或者特发性弱/畸形精 子症患者。 3.根据权利要求1或者2所述的检测男性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法， 其 特征在于， 扩增所述男性不孕不育相关基因对应的引物对的核苷酸序列如SEQ  ID No.1‑ SEQ ID No.326所示。 4.根据权利要求1或者2所述的检测男性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法， 其 特征在于， 所述样本为体液或者组织。 5.一种检测男性不孕不育基因的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包含扩增权利要求1 至4任一项中定义的所述男性 不孕不育基因的引物对。 6.根据权利要求5所述的检测男性不孕不育基因 的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还 包括DNA提取 试剂。 7.根据权利要求5或者6所述的检测男性不孕不育基因的试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒还包括用于文库构建的反应试剂。 8.根据权利要求7所述的检测男性不孕不育基因 的试剂盒， 其特征在于， 所述反应试剂 包括多重PCR聚合酶、 DNA连接酶、 末端修复酶、 dNTPs和PCR缓冲液中的一种或者多种。 9.权利要求5 至8任一项所述的试剂盒在检测男性 不孕不育基因中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于， 检测采用二代测序法。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958967 A 2检测男性不孕不育的基因文库的构建 方法和试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及基 因检测领域， 特别涉及一种检测男性不孕不育的基 因文库的构建方 法和试剂盒。 背景技术 [0002]男性不育是指夫妻双方在无保护性措施的同居下一年及以上， 无法使女方自然受 孕。 男性不育患者主要表现为： 梗阻性无精子症(临床表现为精液常规检查未见精子， 附睾 穿刺/睾丸组织活检可见精子)， 非梗阻性无精子症/严重少精子症(临床表现为精液常规检 查未见精子， 附睾穿刺/睾丸组织活检未见精子， 或者精子数量极度减少等)， 和弱/畸形精 子症(临床表现为精子数量减少、 精子运动能力下降或精子形态畸形)。 [0003]虽然小部分患者可通过体外受精的辅助生殖技术， 产生后代， 但其成功率一直是 生殖医学领域的一个难题， 且当前 的辅助生殖技术助孕流程复杂以及成本高昂， 这给患者 带来巨大的心里压力和经济负担。 另一方面， 目前大多 数患者的病因不明， 通过辅助生殖技 术出生孩 子是否将来 仍有不育的风险一 直让人担忧。 [0004]明确男性不育的病因对于医学基础研究及临床治疗均有重要意义。 男性不育的病 因复杂， 由于男性生殖系统的特殊环 境， 遗传缺陷被认为可能是主要病因， 并有高度的遗传 异质性。 已往的研究揭示， 参与精子发生的基因有数千个， 其中超过800个基因被敲除后， 在 模式动物中显示出雄性不育的表型。 但在人类， 男性不育的遗传病因学研究处于起步阶段， 参与精子发生的基因多达2000多个， 但明确的男性不育致病基因仅仅才100多个， 大量未知 的男性不育致病基因有待发现和阐明其致病机制。 不同的致病基因导致的临床表型和助孕 结局也不一样。 因此， 在临床上明确男性不育患者的遗传学因素对于助孕治疗方案的选择 具有重要意义。 目前已经被发现的与男性无精子症和严重少精子症相关的基因， 包括 MEIOB、 MEI1、 SPO11、 TEX14、 TEX11、 TEX15、 TDRD9、 TDRD7、 SYCE1、 ZMYND15和C11orf80等； 弱畸 形精子症(精子变形和尾部鞭毛组装)的致病基因， 包括DPY19L2、 ZPBP、 PICK1、 SPATA16、 SUN5、 BRDT、 TSGA10、 AKAP3、 AKAP4、 DNAH1、 CFAP43、 CFAP44、 DNAH11、 DNAH5、 SPAG1、 CFAP47、 CFAP58、 CFAP65、 CFAP69、 CFAP70、 CFAP91、 CFAP251、 DNAH2、 DNAH6、 DNAH8、 DNAH10、 DNAH17、 AK7、 ARMC2、 CEP135、 DZIP1、 FSIP2、 QRIC H2、 SPEF2、 TTC29、 TTC21A和WDR6 3等。 [0005]通过对男性不育患者的致病基因进行检测， 即基因诊断(gene、 diagnosis)技术， 明确患者遗传病因， 是目前明确疾病的诊断、 从而进 行有效精准的药物等治疗、 进而选择合 适的辅助生殖助孕方式、 保证生育健康后代和避免出生 缺陷的有效手段。 [0006]目前基因诊断技术主要为基于单个基因外显子区及其侧翼序列的普通一代PCR ‑ Sanger测序技术， 该技术设计较为个性化， 通用性较低。 个性化强也意 味着工作量大， 周期 长， 成本高昂， 因此当前应用一代PCR