(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210692370.0 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 湖南大圣宠医生物科技有限公司 地址 410000 湖南省长 沙市高新 技术产业 开发区谷苑路229号海凭园生产厂房 二301 (72)发明人 汤睿　范文洲　夏慧芝　贾小梅　 毛君杰　邱先锋　罗莎　戴立忠　 (74)专利代理 机构 北京派特恩知识产权代理有 限公司 1 1270 专利代理师 任晓　徐川 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 检测猫口炎病原体并分型的组合物、 试剂 盒、 方法及其用途 (57)摘要 本发明属于分子生物学检测领域； 具体地， 涉及猫口炎病原体的检测； 更具体地， 涉及用于 检测猫杯状病毒、 猫疱疹病毒、 猫白血病毒、 猫艾 滋病毒共4种猫口炎病原 体的组合物。 与此同时， 还提供了包含 所述组合物的试剂盒， 所述组合物 的用途， 以及用于检测猫口炎病原 体并分型的方 法。 本发明提供的检测猫口炎病原 体并分型的组 合物， 主要利用多重荧光PCR和熔解曲线分析方 法， 对猫杯状病毒、 猫疱疹病毒、 猫白血病毒、 猫 艾滋病毒等多种病原体以及内标， 在一管内进行 检测， 使得不同病原体能够得到区别对待， 从而 使得治疗和预防更有效。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图10页 CN 115058541 A 2022.09.16 CN 115058541 A 1.一种用于检测猫口炎病原体并分型的组合物， 所述组合物包括： 如SEQ ID NO:1所示的FHV ‑I上游引物、 如SEQ  ID NO:2所示的FHV ‑I下游引物， 和如SEQ   ID NO:3所示的FHV ‑I探针； 如SEQ ID NO:4所示的FCV上游引物、 如SEQ  ID NO:5所示的FCV下游引物， 和如SEQ  ID  NO:6所示的FCV探针； 如SEQ ID NO:7所示的FeLV上游引物、 如SEQ  ID NO:8所示的FeLV下游引物， 和如SEQ   ID NO:9所示的F eLV探针； 如SEQ ID NO:10所示的FIV上游引物、 如SEQ  ID NO:11所示的FIV下游引物， 和如SEQ   ID NO:12所示的FIV探针。 2.根据权利 要求1所述的组合物， 其 中， 所述组合物还包括如SEQ  ID NO:13所示的内标 上游引物和如SEQ  ID NO:14所示的内标 下游引物。 3.根据权利要求1或2所述的组合物， 其中， 所述组合物各探针的荧光基团彼此互不相 同且互不干扰。 4.根据权利 要求3所述的组合物， 其 中， FHV‑I探针的荧光基团是FAM； FCV探针的荧光基 团是HEX； FeLV探针的荧光基团是ROX； FIV探针的荧光基团是CY5； 内标下游引物的荧光基团 是FAM。 5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物， 其中， 所述组合物以混合的形式存在。 6.权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测猫口炎病原体并分型的试剂盒中 的用途。 7.一种检测猫口炎病原体并分型的试剂 盒， 所述试剂 盒包括权利要求1～5 中任一项所 述的组合物。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其中， 所述试剂盒还包括核酸释放试剂、 核酸提取试 剂、 dNTP、 尿嘧啶糖 基化酶、 DNA聚合酶、 PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。 9.一种用于以非诊断目的检测猫口炎病原体并分型的方法， 所述方法包括以下步骤： 1)提取或释放待测样本的核酸； 2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或如权利要求7～8中任一项所述的试 剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧 光定量PCR分析； 3)获得并分析 结果。 10.根据权利要求9所述的方法， 其中所述 荧光定量PCR的反应条件为： 逆转录， 温度为50℃～60℃， 时间5～15分钟， 1次循环； Taq酶活化， 温度为95℃， 时间1 ～10分钟， 1次循环； 变性， 温度为95℃， 时间为5～20秒， 退火， 温度为55℃ ～60℃， 时间为20 ～60秒， 40～5 0次循环， 熔解曲线分析， 62℃～75℃， 一次循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058541 A 2检测猫口炎病原体并分型的组合物、 试剂盒、 方 法及其用途 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检测领域； 具体地， 涉及猫口炎病原体的检测； 更具体地， 涉及猫杯状病毒、 猫疱疹病毒、 猫白血病毒、 猫艾滋病毒共4种猫口炎病原体的检测。 背景技术 [0002]随着社会经济发展及人们生活品质的提升， 我国宠物行业得到了飞速发展， 宠物 健康也日益受到宠物主人和宠物医师的重视。 猫口炎(feline  stomatitis)疾病是临床中 非常常见的疾病之一， 临床中流浪猫和家猫均有发病， 其中又以流 浪猫居多。 猫口腔发炎溃 疡性疾病(猫口炎)是发生在猫口腔黏膜表层或深层组织的炎症， 可以由口腔的原发性疾病 或全身性疾病继发形成， 炎症的表现可能是局部性的也可能是弥漫性的。 该病诱因较为复 杂， 例如由各种尖锐的异物， 如骨片、 刺、 铁丝、 钢针、 木刺等的刺激， 不整齐的牙齿受损伤， 以及吞食 具有腐蚀性的化学毒 素或缺乏维生素A、 B2 等， 都可能会导致口炎的发生。 另外， 像 某些传染病， 比如猫气管炎病毒、 猫萼状病毒， 是造成猫溃疡性舌炎的病原。 J.O.Knowles等 在1989年 提出， 猫患口炎表现的临床症状比其 他任何动物都严重， 治疗也尚缺乏有效手段。 [0003]猫杯状病毒(FCV)， 为杯状病毒科， 水疮性病毒属， 是一种单链RNA病毒。 FCV是猫病 毒性呼吸道传染病主要表现为口腔溃疡、 眼鼻分泌物增多、 流涎、 结膜炎、 羞明、 口腔炎、 气 管炎、 支气管炎， 伴有双相热。 是猫的多发病， 发病率高， 强毒株感染可发生肺炎、 呼吸困难、 甚至死亡。 主要传染源为病猫和带毒猫， 病猫在急性期可随分泌物和排泄物排出大量病毒， 直接传染易感猫。 带毒猫经治疗， 可成为无症状的病原携带者， 但临床康复后仍长期排毒， 是危险的传染源。 近年来在中国、 美国、 英国和意大利等国家相继暴发了由FCV感染引起猫 的恶性系统性疾病(FCV ‑associateedvirulentsystemicdisease)， 该毒株被称为FCV ‑VSD 株， 可感染成年猫并导致高热、 水肿、 头部和四肢溃疡及黄疸等症状， 并且呈现较高的死亡 率。 FCV不仅可以感染猫， 也可感染虎、 狮等野生猫科动物， 是流行于猫科动物中的一种重要 的病原。 [0004]猫疱疹病毒I型(Feline  herpesvirus  type1,FHV ‑I)又叫猫鼻气管炎病毒， 属疱 疹病毒科， 甲型疱疹病毒亚科， 是一种有囊膜的双链DNA病毒。 FHV ‑I可引起猫的急性和高度 接触性的上呼吸道感染， 发病率可高达100％。 虽然成年猫感染后大多能够痊愈， 主要侵害 幼猫的上呼吸道和眼部， 感染症状严重时， 出现体温升高， 精神沉郁、 咳嗽、 打喷嚏等明显的 上呼吸道感染症状以及眼脓性分泌物、 角膜结膜炎等眼部症状， 严重感染可造成小叶性肺 炎， 眼周皮肤溃疡。 幼猫病死率可达50％， 而且终生带毒排毒， 并可垂直传播， 危害很大。 病 毒在病猫的鼻、 咽喉、 气管和支气管以及舌、 结膜等部位增殖。 此外， 患病猫康复后FHV ‑I仍 可潜伏于三叉神经、 视神经、 扁桃体等部位造成终身 带毒， 在猫免疫力低下或发生应激反应 时引起二次感染， 引起慢性鼻窦炎、 鼻 甲骨变性、 树枝状角膜炎等临床症状。 该病最早从美 国发现， 随后在加拿大、 英国、 荷 兰、 瑞士、 匈牙利、 越南等地 发现和流行， 我国已多次发现可 疑病例， 并分离到病毒。 但目前在实验动物国家标准及地方标准中， 均没有对实验用猫的检 测要求及相关规定 。说　明　书 1/7 页 3 CN 115058541 A 3