(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210692445.5 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 湖南大圣宠医生物科技有限公司 地址 410000 湖南省长 沙市高新 技术产业 开发区谷苑路229号海凭园生产厂房 二301 (72)发明人 邱先锋　范文洲　林星　毛君杰　 汤睿　罗莎　戴立忠　 (74)专利代理 机构 北京派特恩知识产权代理有 限公司 1 1270 专利代理师 黄景辉　胡春光 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/42(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/145(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 检测猪腹泻病原体并分型的组合物、 试剂 盒、 方法及其用途 (57)摘要 本发明属于分子生物学检测领域； 具体地， 涉及猪腹泻病原体的检测； 更具体地， 涉及用于 检测猪霍乱沙门氏菌(SC)、 胞内劳森菌(LI)、 猪 痢疾短螺旋体(BH)、 致病性大肠杆菌(ETEC)、 产 气荚膜梭菌(Cp)、 艰难梭菌(Cd)的组合物。 与此 同时， 还提供了包含所述组合物的试剂盒， 所述 组合物的用途， 以及用于检测猪腹泻病原体并分 型的方法。 该组合物主要利用多重荧光PCR和熔 解曲线分析方法在一管内进行检测， 使得不同病 原体能够得到区别对待， 从而使得治疗和预防更 有效。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图8页 CN 115058528 A 2022.09.16 CN 115058528 A 1.一种用于检测猪 腹泻病原体并分型的组合物， 所述组合物包括： 第一核酸组合物： 如SEQ ID NO:1所示的猪霍乱沙门氏菌上游引物、 如SEQ  ID NO:2所示的猪霍乱沙门氏 菌下游引物， 和如SEQ  ID NO:3所示的猪霍乱沙门氏菌 探针； 如SEQ ID NO:4所示的胞 内劳森菌上游引物、 如SEQ  ID NO:5所示的胞 内劳森菌下游引 物， 和如SEQ  ID NO:6所示的胞内劳森菌 探针； 以及 如SEQ ID NO:7所示的猪痢疾短螺旋体上游引物、 如SEQ  ID NO:8所示的猪痢疾短螺旋 体下游引物， 和如SEQ  ID NO:9所示的猪痢疾短螺 旋体探针。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其中， 所述组合物进一 步包括： 第二核酸组合物： 如SEQ ID NO:10所示的致病性大肠杆菌上游引物， 和如SEQ  ID NO:11所示的致病性大 肠杆菌下游引物； 如SEQ ID NO:12所示的产气 荚膜梭菌上游引物， 和 如SEQ ID NO:13所示的产气 荚膜梭 菌下游引物； 以及 如SEQ ID NO:14所示的艰难梭菌上游引物， 和 如SEQ ID NO:15所示的艰难梭菌下游引 物。 3.根据权利要求1所述的组合物， 其中， 所述第一核酸组合物进一步包括： 如SEQ  ID  NO:16所示的内标上游引物、 如SEQ  ID NO:17所示的内标下游引物， 和如SEQ  ID NO:18所示 的内标探针。 4.根据权利要求3所述的组合物， 其中， 所述各核酸组合物中各探针的荧光基团彼此互 不相同且互不干扰。 5.根据权利要求4所述的组合物， 其中， 猪霍乱沙门氏菌的荧光报告基团为FAM； 内标的 荧光报告基团为HEX； 胞内劳森菌的荧光报告基团为ROX； 猪痢疾短螺旋体的荧光报告基团 为CY5； 致病性大肠杆菌的上游引物荧光报告基团为FAM； 产气荚膜梭菌的上游引物荧光报 告基团为H EX； 艰难梭菌的上游引物荧 光报告基团为ROX。 6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物， 其中， 所述组合物以混合的形式存在。 7.权利要求1～6中任一项所述的组合物在制备检测猪腹泻病原体并分型的试剂盒中 的用途。 8.一种检测猪腹泻病原体并分型的试剂 盒， 所述试剂 盒包括权利要求1～6 中任一项所 述的组合物。 9.根据权利要求7所述的试剂盒， 其中， 所述试剂盒还包括核酸释放试剂、 核酸提取试 剂、 dNTP、 尿嘧啶糖 基化酶、 DNA聚合酶、 PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。 10.一种用于以非诊断目的检测猪 腹泻病原体并分型的方法， 所述方法包括以下步骤： 1)提取或释放待测样本的核酸； 2)使用如权利要求1～6中任一项所述的组合物或如权利要求8或9所述的试剂盒对步 骤1)获得的核酸进行荧 光定量PCR分析； 3)获得并分析 结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058528 A 2检测猪腹泻病原体并分型的组合物、 试剂盒、 方 法及其用途 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检测领域； 具体地， 涉及猪腹泻病原体的检测； 更具体地， 涉及猪霍乱沙门氏菌(SC)、 胞内劳森菌(LI)、 猪痢疾短螺旋体(BH)、 致病性大肠杆菌 (ETEC)、 产气荚膜梭菌(Cp)、 艰难梭菌(Cd)的检测。 背景技术 [0002]新生仔猪的腹泻 发病率很高， 是一种 常见且很难防控的疾病， 80％～90％的母猪 场都会存在新生仔猪腹泻问题， 而且以后备母猪群出现产后仔猪腹泻为主， 仔猪发病率超 过50％； 经产母猪群的仔猪发病率在30％～35％。 猪场发生腹泻的影 响因素有很多， 比如病 毒性感染、 细菌行感染和寄生虫感染。 其中， 病毒性感染就是生猪感染某些致病病毒 所造成 的猪腹泻病症,包括传染性肠胃炎病毒、 流行性腹泻病毒、 轮状病毒、 猪伪狂犬病病毒、 猪瘟 病毒、 腺病毒以及疱疹病毒等。 细菌性感染同样也是生猪受到外来病菌的入侵所产生的腹 泻症状,包括大肠杆菌、 沙门氏菌、 魏氏梭菌、 猪痢疾杆菌、 艰难梭菌、 内劳森氏菌以及短螺 旋体等病菌的感染， 均会有引发猪腹泻的可能。 寄生虫感染， 并不是所有的寄生虫都会引发 猪腹泻， 一般来说， 只有引发肠道感染的寄生虫才会造成猪腹泻， 比如烟虫、 鞭虫、 球虫、 蛔 虫以及结肠小袋纤毛虫等寄生虫。 通过改善猪饲养环境和提高猪饲料配比与管理的科学 性， 能够有效降低寄生虫对猪造成的感染现象。 [0003]目前来说， 腹泻的病发主要关注于病毒性的感染， 对于细菌性的感染则缺乏监控， 这主要在于养殖过程中抗生素的大量使用是其主要的治疗与预防方式， 随着国家推行的减 抗、 禁抗政策， 以及精准用抗， 本领域需求一种产品能够检测并区分不同细菌的感染， 以便 能够给予针对性的治疗， 同时成本低， 灵敏度高。 发明内容 [0004]有鉴于此， 第一方面， 本发明提供一种用于检测猪腹泻病原体并分型的组合物， 所 述组合物包括： [0005]第一核酸组合物： [0006]如SEQ ID NO:1所示的猪霍乱沙门氏菌上游引物、 如SEQ  ID NO:2所示的猪霍乱沙 门氏菌下游引物， 和如SEQ  ID NO:3所示的猪霍乱沙门氏菌 探针； [0007]如SEQ ID NO:4所示的胞内劳森菌上游引物、 如SEQ  ID NO:5所示的胞内劳森菌下 游引物， 和如SEQ  ID NO:6所示的胞内劳森菌 探针； 和 [0008]如SEQ ID NO:7所示的猪痢疾短螺旋体上游引物、 如SEQ  ID NO:8所示的猪痢疾短 螺旋体下游引物， 和如SEQ  ID NO:9所示的猪痢疾短螺 旋体探针。 [0009]进一步地， 所述组合物还 包括： [0010]第二核酸组合物： [0011]如SEQ ID NO:10所示的致病性大肠杆菌上游引物， 和如S EQ ID NO:11所示的致病 性大肠杆菌下游引物；说　明　书 1/7 页 3 CN 115058528 A 3