(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210733666.2 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 湖南大圣宠医生物科技有限公司 地址 410000 湖南省长 沙市高新 技术产业 开发区谷苑路229号海凭园生产厂房 二301 (72)发明人 毛君杰　范文洲　王洁　汤睿　 邱先锋　罗莎　戴立忠　 (74)专利代理 机构 北京派特恩知识产权代理有 限公司 1 1270 专利代理师 张凡　蒋雅洁 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/42(2006.01) C12R 1/145(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 检测牛腹泻病原体并分型的组合物、 试剂 盒、 方法及其用途 (57)摘要 本发明属于分子生物学检测领域； 具体地， 涉及牛腹泻病原体的检测； 更具体地， 涉及用于 检测沙门氏菌、 魏氏梭菌、 大肠杆菌K99、 痢疾志 贺氏菌、 空肠弯曲杆菌、 奇异 变形杆菌共6种牛腹 泻致病病原体的组合物。 与此同时， 还提供了包 含所述组合物的试剂盒， 所述组合物的用途， 以 及用于检测牛腹泻病原体并分型的方法。 该组合 物主要利用多重荧光PCR和熔解曲线分析方法在 一管内进行检测， 使得不同病原 体能够得到区别 对待， 从而使得治疗和预防更有效。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图9页 CN 114774564 A 2022.07.22 CN 114774564 A 1.一种用于检测牛腹泻病原体并分型的组合物， 其特 征在于， 所述组合物包括： 第一核酸组合物： 如SEQ ID NO:1所示的沙门氏菌上游引物、 如SEQ  ID NO:2所示的沙门氏菌下游引物， 和如SEQ ID NO:3所示的沙门氏菌 探针； 如SEQ ID NO:4所示的魏氏梭菌上游引物、 如SEQ  ID NO:5所示的魏氏梭菌下游引物， 和如SEQ ID NO:6所示的魏氏梭菌 探针； 如SEQ ID NO:7所示的大肠杆菌K99上游引物、 如SEQ  ID NO:8所示的大肠杆菌K99下游 引物， 和如SEQ  ID NO:9所示的大肠杆菌K9 9探针； 和 如SEQ ID NO:10所示的痢疾志贺氏菌上游引物、 如SEQ  ID NO:11所示的痢疾志贺氏菌 下游引物， 和如SEQ  ID NO:12所示的痢疾志贺氏菌 探针。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特 征在于， 所述组合物进一 步包括： 第二核酸组合物： 如SEQ ID NO:13所示的空肠弯曲杆菌上游引物， 和 如SEQ ID NO:14所示的空肠弯曲杆 菌下游引物； 和 如SEQ ID NO:15所示的奇异变形杆菌上游引物， 和 如SEQ ID NO:16所示的奇异变形杆 菌下游引物。 3.根据权利要求2所述的组合物， 其特征在于， 所述第二核酸组合物进一步包括： 如SEQ   ID NO:17所示的内标 上游引物， 和如SEQ  ID NO:18所示的内标 下游引物。 4.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述第 一核酸组合物中各探针的荧光基 团彼此互不相同且互不干扰。 5.根据权利要求3或4所述的组合物， 其特征在于， 所述第二核酸组合物中各上游引物 包括彼此互不相同且互不干扰的荧 光报告基团。 6.根据权利要求5所述的组合物， 其特 征在于， 所述组合物以混合的形式存在。 7.权利要求1~6中任一项所述的组合物在制备检测牛腹泻病原体并分型的试剂 盒中的 用途。 8.一种检测牛腹泻病原体并分型的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1~6 中任一项所述的组合物。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括核酸释放试剂、 核酸 提取试剂、 dNTP、 尿嘧啶糖 基化酶、 DNA聚合酶、 PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。 10.一种用于以非诊断目的检测牛腹泻病原体并分型的方法， 其特征在于， 所述方法包 括以下步骤： 1） 提取或释放待测样本的核酸； 2） 使用如权利要求1~6中任一项所述的组合物或如权利要求8或9所述的试剂盒对步骤 1） 获得的核酸进行荧 光定量PCR分析； 3） 获得并分析 结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774564 A 2检测牛腹泻病原体并分型的组合物、 试剂盒、 方 法及其用途 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检测领域； 具体地， 涉及牛腹泻病原体的检测； 更具体地， 涉及沙门氏菌、 魏氏梭菌、 大肠杆菌K99、 痢疾志贺氏菌、 空肠弯曲杆菌、 奇异变形杆菌共6种 牛腹泻致病 病原体的检测。 背景技术 [0002]牛腹泻是由肠道内细菌、 病毒、 寄生虫等病原微生物或营养性因素、 环境性因素等 致使牛特别是犊牛免疫力低下所表现出来的一种征候群， 临床表现为精神沉郁、 食欲废食、 高热、 腹胀、 腹痛、 胃肠炎、 腹泻、 粪便恶臭、 发黑、 间或混有 血丝气泡、 脱 水和酸中毒症状。 造 成牛腹泻特别是犊牛腹泻病因比较复杂， 生物学因素、 管理因素、 环境因素、 营养性因素均 可导致本病的发生。 其中病原微生物感染是造成牛腹泻的重要原因， 如沙门氏菌、 魏氏梭 菌、 大肠杆菌K99、 痢疾志贺氏菌、 空肠弯曲杆菌、 奇异变形杆菌等均是引起牛腹泻的常见细 菌。 该病的发生严重影响着犊牛 的生长发育和成年牛 的生产性能， 给养牛业造成巨大 的经 济损失。 [0003]目前来说， 腹泻的病发主要关注于病毒性的感染， 对于细菌性的感染则缺乏监控， 这主要在于养殖过程中抗生素的大量使用是其主要的治疗与预防方式， 随着国家推行的减 抗、 禁抗政策， 以及精准用抗， 本领域需求一种产品能够检测并区分不同细菌的感染， 以便 能够给予针对性的治疗， 同时成本低， 灵敏度高。 发明内容 [0004]有鉴于此， 第一方面， 本发明提供一种用于检测牛腹泻病原体并分型的组合物， 所 述组合物包括： 第一核酸组合物： 如SEQ ID NO:1所示的沙门氏菌上游引物、 如S EQ ID NO:2所示的沙门氏菌下游引 物， 和如SEQ  ID NO:3所示的沙门氏菌 探针； 如SEQ ID NO:4所示的魏氏梭菌上游引物、 如S EQ ID NO:5所示的魏氏梭菌下游引 物， 和如SEQ  ID NO:6所示的魏氏梭菌 探针； 如SEQ ID NO:7所示的大肠杆菌K99上游引物、 如S EQ ID NO:8所示的大肠杆菌K99 下游引物， 和如SEQ  ID NO:9所示的大肠杆菌K9 9探针； 和 如SEQ ID NO:10所示的痢疾志贺氏菌上游引物、 如SEQ  ID NO:11所示的痢疾志贺 氏菌下游引物， 和如SEQ  ID NO:12所示的痢疾志贺氏菌 探针。 [0005]进一步地， 所述组合物还 包括： 第二核酸组合物： 如SEQ ID NO:13所示的空肠弯曲杆菌上游引物， 和如SEQ  ID NO:14所示的空肠弯 曲杆菌下游引物； 和 如SEQ ID NO:15所示的奇异变形杆菌上游引物， 和如SEQ  ID NO:16所示的奇异变说　明　书 1/7 页 3 CN 114774564 A 3