(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210770639.2 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 杭州博日科技股份有限公司 地址 310000 浙江省杭州市滨江区高新 技 术产业开发区滨安路1 192号 (72)发明人 周鑫鑫　田星　王虹军　陈芝娟　 贺贤汉　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 张金铭 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 检测流感病毒H5、 H7、 H9亚型的引物和探针 及其应用、 试剂和数字PCR试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种检测流感病毒H5、 H7、 H9 亚型的引物和探针及其应用、 试剂和数字PCR试 剂盒， 涉及生物技术领域。 本发明提供的检测流 感病毒H5、 H 7、 H9亚型的引物和探针， 其中引物具 有如SEQ ID NO.1‑6所示的核酸序列， 探针具有 如SEQ ID NO.7‑9所示的核酸序列， 该引 物和探 针特异性强， 灵敏度高， 能够用于制备检测流感 病毒H5、 H7、 H9亚型的产品， 实现对流感病毒H5、 H7、 H9亚型的检测。 权利要求书1页 说明书7页 序列表6页 附图6页 CN 114959121 A 2022.08.30 CN 114959121 A 1.一种检测流感病毒H5、 H7、 H9亚型的引物和探针， 其特征在于， 所述引物包括第一引 物对、 第二引物对和第三引物对； 所述第一引物对具有如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的核酸序列； 所述第二引物对 具有如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示的核酸序列； 所述第 三引物对具有如SEQ  ID NO.5 和SEQ ID NO.6所示的核酸序列； 所述探针包括第一探针、 第二探针和第三探针； 所述第一探针具有如SEQ  ID NO.7所示的核酸序列； 所述第二探针具有如SEQ  ID NO.8 所示的核酸序列； 所述第三探针具有如SEQ  ID NO.9所示的核酸序列。 2.根据权利要求1所述的引物和探针， 其特征在于， 所述探针的5 ’端连接有荧光报告基 团， 3’端连接有荧 光淬灭基团。 3.根据权利要求2所述的引物和探针， 其特征在于， 所述荧光报告基团包括FAM、 CY5或 HEX； 优选地， 所述 荧光淬灭基团包括TAMRA、 BHQ1或BHQ2。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的引物和探针在制备流感病毒H5、 H7、 H9亚型检测产品中的 应用； 优选地， 所述检测产品包括数字PCR试剂盒。 5.一种试剂， 其特 征在于， 包括权利要求1 ‑3任一项所述的引物和探针。 6.一种数字PCR试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑3任一项所述的引物和探针以及 数字PCR反应预混液。 7.根据权利 要求6所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 所述数字PCR反应预混液， 包括： Buffer、 Mg2+、 dNTPs、 热启动Taq酶和逆转录酶。 8.根据权利要求6所述的数字PCR试剂盒， 其特 征在于， 还 包括阳性对照品； 所述阳性对照品包括H 5亚型H基因片段、 H7亚型H基因片段和H9亚型H基因片段。 9.根据权利 要求8所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照品为含有H5亚型H 基因片段、 H7亚型H基因片段和H9亚型H基因片段的重组质粒。 10.根据权利要求6所述的数字PCR试剂盒， 其特 征在于， 还 包括阴性对照品； 所述阴性对照品为无核酸酶水。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959121 A 2检测流感病毒H5、 H7、 H9亚型的引物和探针及其应用、 试剂 和 数字PCR试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 尤其是涉及一种检测流感病毒H5、 H7、 H9亚型的引物和 探针及其应用、 试剂和数字PCR试剂盒。 背景技术 [0002]流感病毒(Influenza  virus)在病毒分类学上属于正粘病毒科。 主要通过空气 中 的飞沫、 易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播， 一般秋冬季节是其高 发期。 流感病毒包括人流感病毒和动物流感病毒， 人流感病毒分为甲(A)、 乙(B)、 丙(C)三 型， 是流感的病原体。 其中甲型流感病毒抗原性易发生变异， 可以进一步分为H1N1、 H5N1、 H7N9等亚型， 其中的H和N分别代表流感病毒两种表面糖蛋白。 至今发现能直接感染人的禽 流感病毒 亚型有： H5N1、 H 7N1、 H7N2、 H7N3、 H7N7、 H9N2和H 7N9亚型。 根据禽流感病毒致病性和 毒力的不同， 可以将禽流感分为高致病性禽流 感、 低致病性禽流感和无致病性禽流感。 高致 病性禽流感目前有H5N1亚型和 H7N9亚型尤为引人关注， 不仅造成了人类的伤亡， 同时重创 了家禽养殖业。 [0003]现有流感病毒检测方法包括分子诊断和免疫诊断两大方面。 分子诊断技术包括反 转录‑聚合酶链式反应(RT ‑PCR)， 环介导等温核酸扩增技术(LAMP)， 核酸分子杂交， 数字 PCR， 基因芯片等。 免疫 诊断技术包括酶联免疫(EL ISA)， 荧光免疫， 化学发光， 胶体金等。 [0004]数字PCR比传统的RT ‑PCR具有更高的灵敏度和准确性， 最低能够检测出单个拷贝 数的样本。 通过对核酸 随机分配到大量的反应单元中进行扩增反应， 扩增结束后对每个反 应单元的荧光信号进 行采集， 最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度 或含量的PCR技术。 然而目前还缺少一种能够同时实现对流感病毒H5、 H7、 H9亚型检测且适 用于微滴数字PCR的试剂盒。 [0005]有鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0006]本发明的第一目的在于提供一种检测流感病毒H5、 H7、 H9亚型的引物和探针， 以解 决上述问题中的至少一种。 [0007]本发明的第二目的在于提供上述引物和探针在制备流感病毒H5、 H7、 H9亚型检测 产品中的应用。 [0008]本发明的第三目的在于提供一种试剂。 [0009]本发明的第四目的在于提供一种数字PCR试剂盒。 [0010]第一方面， 本发明提供了一种检测流感病毒H5、 H7、 H9亚型的引物和探针， 所述引 物包括第一引物对、 第二引物对和第三引物对； [0011]所述第一引物对具有如S EQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的核酸序列； 所述第二引 物对具有如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示的核酸序列； 所述第三引物对具有如SEQ  ID 说　明　书 1/7 页 3 CN 114959121 A 3