(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210934876.8 (22)申请日 2022.08.04 (71)申请人 北京林业大 学 地址 100083 北京市海淀区清华 东路35号 (72)发明人 安新民　薛胤轩　吴茹茜　陈婷婷　 李影　鲁海琳　齐婉芯　郭斌　 (74)专利代理 机构 北京思元知识产权代理事务 所(普通合伙) 11598 专利代理师 余光军 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测山杨基因组的PCR特异性引物以及PCR 检测方法 (57)摘要 本发明公开了检测山杨 基因组的PCR特异性 引物以及PCR检测方法。 本发明基于银白杨、 新疆 杨、 响叶杨和山杨的基因组， 通过全基因组序列 比对分析发现基因组中具有较大差异的片段， 并 据此设计每种杨树特异引物， 从中筛选出能够将 山杨基因组与其它杨树基因组进行准确区分的 特异性引物。 本发明进一步提供了应用该特异性 引物建立快速区分山杨与其他杨属树种的PCR检 测方法。 本发 明方法可以快速区分山杨与其他杨 属树种， 采用PCR检测方法操作方便， 带型简单， 不需要测序直接通过扩增片段即可区分出山杨 特异基因组片段， 在杨树种植资源分类、 利用及 杂交种的鉴定方面具有应用前 景。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 115074460 A 2022.09.20 CN 115074460 A 1.将山杨(Populus  davidiana  Dode)与其它杨树基因组相区分的特异性PCR引物对， 其特征在于， 选自引物对1或引物2中的任何一对； 所述引物对1的上游引物的核苷酸序列 为 ： CCGAAAATGAGCTGGGGGAT ， 所述引物对1的下游引物的核苷酸序列为 ： AGCAGACAGTGAC CTGCTTC； 所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为： AGTACCTCATAA GACCACCATTC， 所述引物对2的 下游引物的核苷酸序列为： GAGCAGCAT TAGCCATCAGTTTA。 2.权利要求1所述的特异性PCR引物对在检测山杨基因 组中的应用。 3.一种将山杨(Populus  davidiana  Dode)与其他杨属树种相区分的PCR检测方法， 其 特征在于， 包括： (1)提取待检测的杨树样品DNA； (2)以提取的杨树样品DNA为模板， 以权利要求1的引物对1的上游引物和下游引物为 PCR扩增引物对建立PCR反应 体系进行PCR扩增； (3)如果出现了特异性的扩增条 带， 则表明待检测的杨树样品中含有山杨基因 组成分。 4.根据权利要求3所述的PCR检测方法， 其特征在于， 所述的特异性的扩增条带的碱基 长度是739bp。 5.一种将山杨(Populus  davidiana  Dode)与其他杨属树种相区分的PCR检测方法， 其 特征在于， 包括： (1)提取待检测的杨树样品DNA； (2)以提取的杨树样品DNA为模板， 以权利要求1的引物对2的上游引物和下游引物为 PCR扩增引物对建立PCR反应 体系进行PCR扩增； (3)如果出现了特异性的扩增条 带， 则表明待检测的杨树样品是山杨。 6.根据权利要求5所述的PCR检测方法， 其特征在于， 所述的特异性的扩增条带的碱基 长度是484bp。 7.根据权利要求3或5所述的PCR检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所建立的PCR反应体 系包括： 待检测的样品DNA  2 μL， PCR Mix 10 μL， 上游引物0.5 μL， 下游引物0.5 μL， 双蒸水7 μ L。 8.根据权利要求3或5所述的PCR检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述的PCR扩增的程 序包括： 95℃5mi n， 95℃30s， 退火3 0s， 72℃3 0s， 35个循环， 72℃5mi n， 12℃,∞。 9.一种检测 山杨基因组的PCR检测试剂盒， 包括： Taq酶， dNTP， Mg2+， ddH2O和PCR扩增引 物对； 其特征在于， 所述的P CR扩增引物对选自引物对1或引物2中的任何一对； 所述引物对1 的上游引物的核苷酸序列为： CCGAAAATGAGCTGGGGGAT， 所述引物对1的下游引物的核苷酸序 列为： AGCAGACAGTGAC CTGCTTC； 所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为： AGTACCTCATAA GACCACCATTC， 所述引物对2的 下游引物的核苷酸序列为： GAGCAGCAT TAGCCATCAGTTTA。 10.权利要求9所述的PCR检测试剂盒在检测山杨基因 组中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074460 A 2检测山杨基因组的PCR特异性引物以及PCR检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及检测杨树种类的引物以及PCR检测方法， 尤其涉及检测山杨(Populus   davidiana  Dode)基因组的PCR特异性引物以及PCR检测方法， 属于山杨 基因组的PCR检测领 域。 背景技术 [0002]目前针对不同树种鉴定的引物主要以SSR为主， 但SSR引物存在于所有物种中， 基 因组水平不够特异， 迄今为止， 缺少仅针对山杨的基因组特异的鉴定引物， 这种特异引物可 以快速鉴定出某一树种中是否有山杨的基因组成分， 从而 可以推断山杨是否参与了该树种 的形成。 发明内容 [0003]本发明的目的之一是提供准确鉴别山杨基因 组的特异性PCR引物对； [0004]本发明的目的之二是提供一种快速区分山杨与其 他杨属树种的PCR检测方法； [0005]本发明的目的之三是提供一种检测山杨基因 组的PCR检测试剂盒。 [0006]本发明的上述目的是通过以下技 术方案来实现的： [0007]本发明的一方面是提供了将山杨与其它杨树基因组相区分的特异性PCR引物对， 选自引物对1或引物2中的任何一对； 所述引物对1的上游引物的核苷酸序列为： C C G A A A A T G A G C T G G G G G A T ， 所 述 引物 对 1的 下 游 引物的 核 苷 酸 序 列 为 ： A G C A G A C A G T G A C C T G C T T C ； 所 述 引物 对 2的 上 游 引物的 核 苷 酸 序 列 为 ： AGTACCTCATAAGACCACCATTC ， 所述引物对2的下游引物的核苷酸序列为 ： GAGCAGCAT TAGCCATCAGTTTA。 [0008]本发明的第二方面是提供了一种快速区分山杨与其他杨属树种的PCR检测方法， 包括： [0009](1)提取待检测的杨树样品DNA； [0010](2)以提取的杨树样品DNA为模板， 以引物对1的上游引物和 下游引物或者以引物 对2所示的上游引物和下游引物为PCR扩增引物建立PCR反应 体系进行PCR扩增； [0011](3)如果扩增结果出现了特性性的扩增条带， 则表明待检测的杨树样品中含有山 杨基因组成分。 [0012]作为本发明的一种优选的具体实施方案， 步骤(2)中所建立 的PCR反应体系包括： 待检测的样品DNA  2 μL， PCR Mix 10 μL， 上游引物0.5 μL， 下游引物0.5 μL， 双蒸水 7 μL。 [0013]作为本发明的一种优选的具体实施方案， 步骤(2)中所述 的PCR扩增的程序包括： 95℃5min， 95℃30s， 退火3 0s， 72℃3 0s， 35个循环， 72℃5mi n， 12℃,∞。 [0014]作为本发明的一种优选的具体实施方案， 步骤(3)中如果是以引物对1的上游引物 和下游引物为PCR扩增引物建立PCR反应体系进行PCR扩增， 所述的特异性的扩增条带的碱 基长度是739bp； 如果是以引物对2的上游引物和下游引物 为PCR扩增引物建立PCR反应体系说　明　书 1/3 页 3 CN 115074460 A 3