(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210587602.6 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 中信湘雅 生殖与遗传专科医院有限 公司 地址 410000 湖南省长 沙市高新 开发区桐 梓坡西路5 67号 (72)发明人 谭跃球　蒙岚岚　涂超峰　何文斌　 袁诗敏　徐西林　谭琛　 (74)专利代理 机构 华进联合专利商标代理有限 公司 44224 专利代理师 王秉丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01)C40B 50/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测女性不孕不育的基因文库的构建方法 和试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种检测女性不孕不育的二代 测序基因文库的构建方法和试剂盒。 所述构建方 法包括： 获取样本的基因组DNA； 对所述基因组 DNA中的女性不孕不育基因进行扩增， 构建检测 女性不孕不育基因的文库； 所述女性不孕不育基 因包括33个。 本发明能针对男性不孕不育的一个 或者多个基因进行扩增并构建检测文库， 该文库 能够用于二代测序， 实现二代测序在男性不孕不 育基因检测中的应用， 采用二代测序对男性不孕 不育基因进行检测， 优点包 括： (1)通量高； (2)成 本低； (3)效率高； (4)测序深度 高。 (5)可重复及 可追溯性。 权利要求书1页 说明书11页 序列表11页 附图2页 CN 114875117 A 2022.08.09 CN 114875117 A 1.一种检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法， 其特征在于， 所述构建方 法包括： 获取样本的基因 组DNA； 对所述基因组DNA中的女性不孕不育基因进行扩增， 构建检测女性不孕不育的二代测 序基因文库； 所述女性不孕不育基因包括TBPL2、 POF1B、 FOXL2、 BMP15、 NOBOX、 FIGLA、 NR5A1、 STAG3、 HFM1、 MCM8、 ERCC6、 SYCE1、 MSH5、 GDF9、 FANCM、 FMR1、 FSHR、 MRPS22、 MCM9、 NUP107、 ESR1、 ESR2、 PSMC3IP、 DMC1、 XRCC2、 LHCGR、 MEIOB、 BNC1、 C14 orf39、 HSF2BP、 DIAPH2、 SY CP2L和ZSW IM7。 2.根据权利要求1所述的检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法， 其特征 在于， 所述样本取自FSH>10mIU/mL的女性患者。 3.根据权利要求1或者2所述的检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法， 其 特征在于， 扩增所述女性不孕不育基因对应的引物对的核苷 酸序列如SEQ  ID No.1‑SEQ ID  No.68所示。 4.根据权利要求1或者2所述的检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法， 其 特征在于， 所述样本为体液或者组织。 5.一种检测女性不孕不育基因的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包含扩增权利要求1 至4任一项中定义的所述女性 不孕不育基因的引物对。 6.根据权利要求5所述的检测女性不孕不育基因 的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还 包括DNA提取 试剂。 7.根据权利要求5或者6所述的检测女性不孕不育基因的试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒还包括用于文库构建的反应试剂。 8.根据权利要求7所述的检测女性不孕不育基因 的试剂盒， 其特征在于， 所述反应试剂 包括多重PCR聚合酶、 DNA连接酶、 末端修复酶、 dNTPs和PCR缓冲液中的一种或者多种。 9.权利要求5 至8任一项所述的试剂盒在检测女性 不孕不育基因中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于， 检测采用二代测序法。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875117 A 2检测女性不孕不育的基因文库的构建 方法和试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及基 因检测领域， 特别涉及一种检测女性不孕不育的基 因文库的构建方 法和试剂盒。 背景技术 [0002]不孕不育是指夫妻双方在无保护性措施的同居下一年及以上无法受孕。 在女性中 (卵子发生障碍)主要表现为早发性卵巢功能不全(POI)和卵巢发育不全， 该疾病的临床特 征包括女性40岁前绝经， 伴有雌激素水平下降和促性腺激素水平上升， 在40岁前的女性群 体中发生率至少为1％， 在原发闭经和继发闭经的女性中发生率分别高达10～28％和4～ 18％。 [0003]目前对于卵子发生障碍导致的女性不孕患者， 供卵和雌激素替代治疗是主要治疗 手段。 但供卵除了有伦理问题外， 还面临卵子来源极度匮乏的难题， 通常需要等待几年时 间； 且由于缺乏患者本身的下丘脑 ‑垂体‑卵巢轴的调控， 长期的激素替代治疗增加了患者 肿瘤发生的风险。 因此， 明确卵子发生障碍遗传病因对于医学基础研究及临床治疗均有重 要意义， 能更好的为 这些患者 提供有效的治疗方案和生育咨询。 [0004]女性不孕 的病因异常复杂， 遗传缺陷可能是主要的病因之一， 并有高度的遗传异 质性， 即多种单基因发生致病突变都可能导致女性不孕。 已往的研究揭示， 参与卵子发生的 基因有数千个， 但由于早期国际关注生殖领域的研究较少， 且早期基因测序技术成本非常 高昂， 因此在人类女性不孕患者群体中， 导致卵子发生障碍的致病基因的研究刚刚处于起 步阶段， 目前明确的致病基因还不到40个(例如目前已经发现的女性早发性卵巢功能不全 和卵巢发育不去等相关的致病基因， 包括FMR1、 DIAPH2、 NR5A1、 STAG3、 HFM1、 SYCE1、 ERCC6、 MSH5、 GDF9、 FANCM、 DMC1以及XRCC2等)， 大量未知的女性卵子发生障碍基因有待发现。 由于 不同的致病基因导致的患者临床表型和 通过辅助生殖技术助孕的结局 也不一样。 因此， 在 临床上明确卵子发生障碍患者的遗传病因对于助孕治疗方案的选择 具有重要意 义。 [0005]通过对不孕女性患者进行致病基因的扩增、 测序和分析(即基因诊断)， 明确患者 存在的遗传基因突变， 是进 行有效精 准的药物等治疗， 进而选择合适的辅助生殖助孕方式， 保证生育健康后代， 避免出生缺陷的有效手段。 目前基因诊断技术主要依赖于： 对所有女性 不孕致病基因的外显子区及其侧翼序列进行针对性的引物设计， 随后进行普通一代PCR扩 增， 接着通过进行Sanger测序和与数据库中的正常人参考序列进行比对， 最终得到患者是 否存在致病基因突变的结果。 该技术设计较为有针对性， 通用性较低。 有针对性强也意味着 工作量大、 周期 长、 成本高昂及不可避免存在漏诊， 因此当前应用一代PCR ‑Sanger测序检测 女性不孕遗传基因突变， 面临极大的挑战。 发明内容 [0006]基于此， 本发明的目的包括提供一种检测女性不孕不育的二代测 序基因文库的构 建方法， 构建的文库能够用于二代测序， 通用性强、 诊断率高、 耗时短。说　明　书 1/11 页 3 CN 114875117 A 3