(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210661597.9 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 华中科技大 学同济医学院附属同济 医院 地址 430030 湖北省武汉市解 放大道1095 号 (72)发明人 陈丽婷　顾佳　纪红艳　周剑峰　 肖敏　黄亮　 (74)专利代理 机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 专利代理师 胡镇西　冯超 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 检测人体液中人疱疹病毒6B型的PCR引物组 及其微滴式数字PCR试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种检测人体液中人疱疹病 毒6B型的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒。 本发明基于人疱疹病毒6B基因组的保守序列设 计特异性引物及MGB水解探针， 从而得到微滴式 数字PCR试剂盒， 本发明通过提取接受了嵌合抗 原受体T细胞治疗后的血液系统疾病患者体液中 的游离DNA， 通过微滴式数字PCR试剂盒检测HHV ‑ 6B DNA， 对辅助临床了解HHV ‑6B感染情况、 鉴别 其他病原 体感染及鉴别CAR ‑T细胞相关性脑病综 合征有重要指导 意义。 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图2页 CN 114807452 A 2022.07.29 CN 114807452 A 1.一种检测人体液中人疱疹病毒6B型的PCR引物组， 其特征在于： 所述PCR引物组由引 物对HHV‑6B‑FR和探针引物H HV‑6B‑P1组成， 其中， 所述引物对H HV‑6B‑FR为： 上游引物H HV‑6B‑F1： 5’ ‑TCCATTGTTTGATTGATTTCCGTAT‑3’， 下游引物H HV‑6B‑R1： 5’ ‑AACGCGGGATGTTCTATTGG‑3’； 所述探针HHV ‑6B‑P1： 5’ ‑CTTGAGCTTGTAGATAAT ‑3’， 且探针HHV ‑6B‑P1的5’端标记有荧 光基团， 其3 ’端标记有非荧 光淬灭基团。 2.根据权利要求1所述的PCR引物组， 其特征在于： 所述探针荧光基团为FAM， 所述非荧 光淬灭基团为MGB。 3.一种检测人体液中中HHV ‑6B的微滴式数字PCR试剂盒， 其特征在于： 所述PCR试剂盒 包括权利要求1所述PCR引物组。 4.根据权利 要求3所述的微滴式数字PCR试剂盒， 其特征在于： 所述微滴式数字PCR试剂 盒还包括数字PCR缓冲液、 微 滴生成油、 微 滴生成卡、 96孔板和铝箔热封膜。 5.根据权利要求3和4所述的微滴式数字PCR试剂盒， 其特征在于： 所述PCR试剂盒还包 括内控基因引物组， 所述内控基因引物组由内控引物对RPP29 ‑FR和内控探针引物RPP29 ‑P， 其中， 所述内控引物对RP P29‑FR为： 上游引物RP P29‑F： 5’ ‑GGCGGTGGTCCTGGAGTACT‑3’， 下游引物RP P29‑R： 5’ ‑AGAGGCCTTTGGCTTTCTTCTT‑3’； 所述内控探针引物RPP29 ‑P： 5’ ‑ACCCGCCACAAGC ‑3’， 且内控探针引物RPP29 ‑P的5’端标 记有荧光基团。 6.一种权利要求3～5任意一项所述的微滴式数字PCR试剂 盒检测人体液中人疱疹病 毒 6B型核酸的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)处理CA R‑T治疗后的血液系统疾病患者体液， 提取上清游离DNA； 其中， 所述体液为外 周血、 尿液和脑脊液中任意 一种； 2)配制微滴式数字PCR反应液： 将所述微滴式数字PCR检测试剂和待测样本DNA模板混 合， 得到微 滴式数字PCR反应混合液； 3)微滴生成： 将所述微滴式数字PCR反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中， 置于 微滴生成仪中生成微 滴； 4)PCR扩增反应： 将所述生成的微滴转移到96孔板中， 盖上铝箔膜， 封膜机进行热封， 封 完膜后将96孔板放入PCR仪进行PCR扩增反应； 5)读取荧光信号： 将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中， 设置好参数条件， 利用软件进 行结果读取和分析。 7.根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 所述微滴式数字PCR反应混 合液的体系如下：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807452 A 2所述微滴式数字PCR反应混合液的体系： 10 μL  2x ddPCR Supermix， 两 组上下游引物各 1 μL， 两组探针各2 μL， DNA样 本2 μL， 体系配好后用小甩机甩到管底， 涡旋震荡仪震荡混匀， 高 速离心12000rpm 2min， 可有效减少微 滴发生过程中气泡产生。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述 步骤3)中， 生成微 滴的方法如下： 将微滴式数字PCR反应混合液加入到微滴发生板内， 然后在对应的其它孔内加入微滴 发生油， 再将微 滴生成板置入微滴发生卡内， 盖上皮套， 放入微 滴发生仪中进行微 滴生成。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于： 所述步骤4)中， PCR扩增反应的条件为： PCR 扩增： 95℃条件下保温5min， 然后95℃ 保温30s、 60℃ 保温1min， 共进行40个循环； 最后在98 ℃条件下保温10mi n， 降温至4℃保温。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807452 A 3