(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211024299.5 (22)申请日 2022.08.24 (71)申请人 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新二路388号武汉光谷国际生 物医药企业加速器1.2期23栋1单元4、 5层 (72)发明人 祝丹平　魏亮　董祥　詹悦　 喻晓雯　 (74)专利代理 机构 武汉蓝宝石专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 42242 专利代理师 廉海涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6841(2018.01)C12Q 1/6811(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探 针组及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及基因检测技术领域， 具体涉及一 种检测PRCC/TFE3基因的荧光原位杂交探针组及 其制备方法和应用。 本发明通过在PRCC和TFE3基 因的目标区域， 构建与目标区域完全互补的长度 为45bp的单链片段作为候选探针， 然后将每一条 序列进行批量BLAST比对， 保证杂交的每一条探 针序列的高特异性； 同时精确控制目标区域的靶 向， 获得说明书表1中所示的1533个核苷酸序列， 再在每个核苷酸序列的两端添加标签序列得到 特征性引物， 以特征性引物为模板， PCR扩增、 纯 化后得到探针组。 采用上述探针组用于检测 PRCC/TFE3基因融合状态， 成本较低且在30分钟 左右即可完成骨髓样本的FISH杂交， 敏感性高， 特异性强且杂交背景干净、 信噪比低。 权利要求书1页 说明书16页 附图1页 CN 115287361 A 2022.11.04 CN 115287361 A 1.检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组， 其特征在于， 该探针组由说明书表 1中所示的15 33个核苷酸序列制备 得到。 2.根据权利要求1所述的检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组， 其特征在 于， 该探针组由权利要求1所述的核苷酸序列通过 添加标签序列后扩增得到 。 3.根据权利要求2所述的检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组， 其特征在 于， 所述核苷酸序列的5 ’端标签序列为： TAATACGACTC  ACTATAGGG； 3 ’端标签序列为： CCGCTGAGCA ATAACTAGCA。 4.根据权利要求2或3所述的检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组， 其特征 在于， PCR扩增体系中含有Alexa  fluor555‑dUTP和Alexa  fluor488‑dUTP。 5.根据权利 要求1～4任一项所述的检测 PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组的 制备方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1， 以PRCC和TFE3基因序列为依据， 在不含重复序列的区域分别设计含45个碱基核苷 酸序列， 设定探针Tm为50℃， GC含量范围为40～60％， 舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序 列后， 得到2001条候选探针， 再经过全基因hg38  BLAST比对分析后， 最终得到1533个核苷酸 序列， 具体参见说明书表1所示； S2， 分别在每条核苷酸序列的5 ’端加上20bp的标签序列、 3 ’端加上20bp的标签序列， 得 到一系列带有标签序列的特征性引物， 其中5 ’端标签序列为： TAATACGACTCACTATAGGG， 3 ’端 标签序列为： CCGCTGAGCA ATAACTAGCA； S3， 合成S2中的特 征性引物并设计其扩增引物； S4， 以特征性引物为模板， 采用步骤S3中的扩增引物在含有Alexa  fluor555 ‑dUTP或 Alexa fluor488‑dUTP的反应 体系中PCR扩增， 将荧 光标记掺入PCR产物中并纯化即得。 6.根据权利 要求5所述的检测 PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组的制备方法， 其特征在于， PCR扩增时所用的引物为： Primer‑F:TAATACGACTCACTATAG G， Primer ‑R: TGCTAGTTATTGCTCAGCG G。 7.一种用于检测 PRCC/TFE3融合基因的试剂盒， 其特征在于， 含有权利 要求1～4任一项 所述的探针组。 8.根据权利要求7所述的用于检测PRCC/TFE3融合基因的试剂盒， 其特征在于， 还包括 如下杂交缓冲液： 20ng/ μL  PRCC基因探针、 20ng/ μL  TFE3基因探针、 体积占比为45％的去离 子甲酰胺、 体积占比为10％的葡聚糖溶液、 2 ×SSC、 50mmol/L  pH8.0～8.8的Tris ‑HCl， 其中 葡聚糖溶 液为质量体积比为5 0％的葡聚糖溶 液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115287361 A 2检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因检测技术领域， 具体涉及一种检测PRCC/TFE3基因的荧光原位杂 交探针组及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]Xp11.2易位性肾细胞癌(tRCC)是一种罕见的肾细胞癌(RCC)亚型， 是TFE3转录因 子基因融合的结果， 在世界卫生组织(WHO)泌尿系统肿瘤分类中被纳入MiT家族tRCC。 在肾 癌中， Xp11.2  tRCC占儿童肾肿瘤的20％至75％， 约占成人肾细胞癌的1.5％。 Xp11.2  tRCC 中最常见的基因融合是Xp11.2上的TFE3基因与1q21位点的PRCC基因发生融合， TFE3基因与 17q25位点的ASPL基因发生融合， 这些基因融合来自于t(X； 1)(p11.2； q12)和t(X； 17) (p11.2； q2 5.3)易位， 其他发生较少的TFE3融合伙伴包括SFPQ、 Nono、 CLTC和RBM10， 它们由t (X； 1)(p11.2； p34)， inv(X)(p11.2q12)， t(X； 17)(p11.2； q23)和inv(X)(p11.2p11.23)引 起， 一些融合 伙伴， 如PARP14,KHTFESRP,LUC7L3和DVL2， 仅在个别患者中被发现。 [0003]荧光原位杂交实验可以用于评估PRCC/TFE3基因融合状态。 传统的商业化FISH探 针主要使用BAC克隆作为探针， 经过荧光分子标记后进行杂交检测， 然而， BAC克隆制备的探 针存在一些非重复序列， 探针特异性不高， 需要使用Cot1 ‑DNA进行非封闭性封闭， 且BAC克 隆制备的探针片段普遍偏大， 长度在20 0～500bp之间， 杂交效率偏低， 杂交时间长 。 发明内容 [0004]针对现有技术所存在的技术问题， 本发明的目的在于提供一种检测PRCC/TFE3融 合基因的荧光原位杂交探针组， 该探针组由说明书表1中所示的1533个核苷酸序列制备得到 。 [0005]作为一种优选的实施方式， 该探针组由上述的核苷酸序列通过添加标签序列后扩 增得到。 [0006]作 为 一 种 优 选 的 实 施 方 式 ， 所 述 核 苷 酸 序 列的 5 ’端 标 签 序 列 为 ： TAATACGACTCACTATAG GG； 3’端标签序列为： C CGCTGAGCA ATAACTAGCA。 [0007]作为一种优选的实施方式， PCR扩增体系中含有Alexa  fluor555 ‑dUTP和Alexa   fluor488‑dUTP。 [0008]本发明还提供了上述探针组的制备 方法， 包括以下步骤： [0009]S1， 以PRCC和TFE3基因序列为依据， 在不含重复序列的区域分别 设计含45个碱基 核苷酸序列， 设定探针Tm为50℃， GC含量范围为40～60％， 舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG 的序列后， 得到2001条候选探针， 再经过全基因hg38  BLAST比对分析后， 最终得到1533个核 苷酸序列， 具体参见说明书表1所示； [0010]S2， 分别在每条核苷酸序列的5 ’端加上20bp的标签序列、 3 ’端加上20bp的标签序 列 ，得 到 一 系 列 带 有 标 签 序 列 的 特 征 性 引 物 ，其 中 5 ’端 标 签 序 列 为 ： TAATACGACTCACTATAG GG， 3’端标签序列为： C CGCTGAGCA ATAACTAGCA；说　明　书 1/16 页 3 CN 115287361 A 3