(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210588190.8 (22)申请日 2022.05.26 (71)申请人 宿迁市绿港现代农业研究院有限公 司 地址 223800 江苏省 宿迁市宿城区埠子镇 宿城现代农业产业园内办公楼二楼 206室 申请人 江苏绿港现代农业发展股份有限公 司 (72)发明人 马士芳　许光立　马蒙　王鹏　 钟泽　李文虎　 (74)专利代理 机构 宿迁市永 泰睿博知识产权代 理事务所(普通 合伙) 32264 专利代理师 杨阳(51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测FCR抗病基因的引物及快速 检测方法 (57)摘要 本发明提供一种检测FCR抗病基因的引物及 快速检测方法， 所述引物包括上游引物InFrl ‑F 和下游引物InFrl ‑R， 其中上游引物InFrl ‑F的序 列为CAAGTGAAGTTAAAAATGCTAAT， 下游引物 InFrl‑F的序列为AACTCCAAATGTAGTACGCTTAC， 其 在抗病品种中扩增出177bp的片段大小， 在感病 品种中扩增出243bp的片段。 本发明中番茄抗性 基因Frl相关标记的序列是在已报道的SCARFrl引 物序列的基础上开发出的片段更小、 多态性更强 的Indel标记， 其具有特异性强， 准确度高的特 点。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 CN 114921584 A 2022.08.19 CN 114921584 A 1.一种检测FCR抗病基因的引物， 其特征在于， 所述引物包括上游引物InFrl ‑F和下游 引物InFrl ‑R， 其中上游引物InFrl ‑F的序列为CAAGTGAAGTTAAAAATGCTAAT， 下游引物InFrl ‑ F的序列为A ACTCCAAATGTAGTACGCT TAC。 2.一种采用权利要求1中引物快速检测FCR抗病基因的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)提取番 茄根冠根腐病抗感材 料的叶片基因 组DNA； (2)利用权利要求1的引物对步骤(1)提取的番 茄材料进行PCR扩增； (3)对步骤(2)扩增后的产物分别进行2％的琼脂糖凝胶电泳和8％的聚丙烯酰胺凝胶 电泳， 显色、 染色。 (4)根据步骤(3)的结果进行判断。 3.根据权利 要求2所述的快速检测FCR抗病基因的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中提 取番茄叶片基因 组DNA采用改良的CTAB法提取。 4.根据权利 要求2所述的快速检测FCR抗病基因的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中进 行PCR扩增时采用的反应体系为20 μL体系， 其中提取番茄叶片基因组DNA  1μL， dNTP(10mM) 0.2 μL， 10*Buffer(Mg+)2 μL， Taq酶0.4， 正 反引物各 1 μL， 加入灭菌的超纯水至2 0 μL； PCR扩增 时反应程序为： 94℃预变性2min； 然后进行35个循环， 每个循环包括94℃变性30s， 58℃退火 30s， 72℃延伸45s； 最后延伸2mi n， 置于4℃保存。 5.根据权利 要求2所述的快速检测FCR抗病基因的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)中在 抗病品种中扩增出177bp的片段大小， 其核苷酸序列表如SEQ  ID NO.5所示， 在感病品种中 扩增出243bp的片段， 其核苷酸序列表如SEQ  ID NO.6所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921584 A 2检测FCR抗病基因的引物及快速检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于农业生物技术领域， 具体涉及 一种基于不同电泳介质的番茄根冠根腐 病抗病基因FCR的快速检测， 对于农业生产中番茄根冠根腐病菌引起的病害快速检测具有 重要的实用价 值。 背景技术 [0002]番茄根冠根腐病(Fusarium  crown and root rot， 简称FCR)， 是由尖孢镰刀菌番 茄颈腐根腐专化型(Fusarium  oxysporum  f.sp.radicis ‑lycopersici， 简称FORL)引起的 一种重要的土传病害。 番茄根冠根腐病主要危害番茄植株的根部， 主要症状表现为在土壤 与番茄植株交接处， 有明显的深褐色病斑； 在感病初期， 植株顶端茎叶萎焉， 不就萎焉的茎 叶小叶变色， 叶缘呈脱水状， 继而叶片褐色干枯； 发病严重时， 病根明显肿胀、 变粗， 茎秆维 管束褐色病变， 茎 秆出现中空枯死现象， 根部逐渐变为褐色 并腐烂。 该病最早于1974年在日 本发现， 随后1976  年在美国的加利福尼亚出现， 之后在很多国家爆发并对番茄的生产造成 重大的损失(Yamamoto  et al.,1974)。 该病在我国的江苏、 山东、 辽宁等地均有报道， 且发 病呈逐年加重的趋势(耿 丽华等， 2012)。 [0003]番茄根冠根腐病属真菌性病害， 病菌能够在土壤中长期存活， 时间可长达  6年， 因 此， 番茄的连作会导致真菌在土壤中长期积累， 并逐渐加重对作 物的侵害， 给农民带来很大 的经济损失。 目前市场上还没有一种对番茄根冠根腐病有效的药剂防治方法， 因此选育抗 番茄根冠根腐病的新品种 是防治该病害最科学有效的方法。 已有研究表明， 番茄根冠根腐 病的抗性基因是由单显性基因Fr l控制的， 且3份抗源 材料中携带相同的Fr l等位基因， 且抗 病基因Frl已被定位到9号染色体上， Vakalounakis等(1997)研究表明抗病基因Frl和Tm ‑2 之间的紧密连锁，  Fazio等(1999)结合不同抗性材料及近等基因系开发了3个与番茄根冠 根腐病抗性基因连锁的RAPD分子标记(UBC ‑116、 194和655)， 尽管UBC ‑116被转化为共显性 的SCAR标记， 但由于该标记与抗性基因Frl的距离为7厘米， 因此该标记不能用于抗性评估 (Truong et al.,2011)。 2014年Staniasz ek等人从F2群体中距 离抗病基因Frl约3cm的保守 序列位点C2 _At2g38025中开发了CAPS标记  C2‑25， 但CAPS标记需要酶切， 成本高， 实验程序 繁琐， 检测效率低(Staniasz ek et al.,2014)。 Nedim等利用对番茄 根冠根腐病抗病的材料 “Fla.7781 ”和感病材料 “B560”进行杂交， F1自交并回交到 “B560”以产生分离的F2和  BC1群 体， 开发共显性的SCAR标记S CARFrl， 但该标记的检测效率不高， 其在抗病品种和感病品种中 分别扩增出95 0bp和1000bp的条带。 [0004]综上所述， 到目前为止， 番茄育种中缺乏能有效鉴定Frl基因的分子标记， 制约了 番茄根冠腐根腐病 抗病品种的育种进程。 SCARFrl标记虽然也能检测是否抗根冠根腐病， 但 其扩增片段太大， 抗感材料差异小， 不易区分， 因此开 发多态性高、 易于操作且片段短的Fr l 基因分子标记， 对选 育抗根冠根腐病的番 茄优良品种具有重要意 义。说　明　书 1/7 页 3 CN 114921584 A 3