(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210602839.7 (22)申请日 2022.05.31 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114672482 A (43)申请公布日 2022.06.28 (73)专利权人 上海百力格生物技 术有限公司 地址 201611 上海市松江区书 海路99号23 幢 (72)发明人 李星豪　蔡晶晶　苏敏　李俊　 (74)专利代理 机构 北京玄法律师事务所 16 002 专利代理师 潘满根 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01)(56)对比文件 CN 110196322 A,2019.09.0 3 CN 104593 355 A,2015.0 5.06 CN 10191409 9 A,2010.12.15 WO 9630377 A1,1996.10.03 林 琳等.DNA分子识别及 传感技术. 《化学通 报》 .2001,(第5期), Alexandre V Lebedev et al., .Preactivated carboxyl l inker for the rapid co njugation of alkylamines to oligonucleotides o n solid support. 《Bioconjug Chem》 .2007,第18卷 审查员 张怡文 (54)发明名称 核酸探针制备方法 (57)摘要 本发明提供一种核酸探针制备方法， 所述制 备方法中带有氨基活性基团的核酸固体与可与 氨基基团反应的活化酯修饰染料固体两者混合 研磨进行一步反应得到核酸探针， 所述核酸固体 和所述染料固体通过机械混合研磨直至成为胶 状物， 在此过程中不加入反应溶剂和其它反应试 剂。 本发明的核酸探针制备方法为无溶剂反应， 不需要有毒有机溶剂的参与， 更加的绿色无污 染； 生产过程大幅度简化， 结合球磨机的使用， 可 以放大生产。 权利要求书1页 说明书16页 CN 114672482 B 2022.08.30 CN 114672482 B 1.一种核酸探针制备方法， 其特征在于， 所述制备方法中带有氨基活性基团的核酸固 体与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料固体两者混合研磨进行一步反应直接得到核酸 探针， 所述核酸固体和所述修饰染料固体通过机械混合研磨直至成为胶状物， 在此过程中 不加入反应溶剂和其它反应试剂； 所述核酸固体为无定型片状固体， 所述 修饰染料固体为晶体 状固体； 所述方法还包括： 将所述胶状物用水直接溶解， 转移至高效液相色谱仪上纯化， 得到纯 化的核酸探针； 所述核酸固体与所述 修饰染料固体摩尔比例为1:1 ‑1:4； 所述制备方法中带有氨基活性基团的核酸固体与可与氨基基团反应的活化酯修饰染 料固体两者混合研磨时间为5 ‑20分钟； 和 所述反应活性酯是琥珀酰 亚胺活化酯或异硫氰酸活化酯。 2.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述核酸 为DNA或RNA。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述核酸为碱基长度在46个碱基以上 的DNA， 或者核酸 为碱基长度在37个碱基以上的RNA。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 所述核酸固体与所述修饰染料固体摩尔比例为1: 2。 5.根据权利要求1所述的制备 方法， 所述核酸中碱基数不少于2 2个。 6.根据权利要求1所述的制备 方法， 所述混合研磨使用研钵或球磨机进行研磨。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672482 B 2核酸探针制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技 术领域， 特别涉及一种核酸探针制备 方法。 背景技术 [0002]单链DNA与RNA是由一定数量的脱氧核苷酸或者核苷酸 组合而成。 而对D NA或者RNA 的结构进行一些改造， 就形成了DNA修饰探针以及RNA修饰探针。 DNA修饰探针与RNA修饰探 针广泛应用在分子诊断QPCR （实时荧光定量） 、 STR （短串联重复序列） 、 以及FISH （荧光原位 杂交技术） 等领域。 [0003]一般地， 有两种常见的方法可用于单链DNA与RNA的改造。 一种为固相 亚磷酰胺三 酯法， 另一种为液相氨基活化酯加成法。 传统的液相氨基活化酯加成法是把含有氨基活性 基团的DNA或RNA溶解在碱性的缓冲液中， 然后加入3倍摩尔量的有机溶剂溶解的修饰染料 活化酯， 在常温反应4 ‑12小时， 然后加入酒精进行沉淀， 同时用酒精对沉淀物进行反复洗 涤， 拿到沉淀固体， 然后用水溶解， 最后经高效液相色谱仪纯化得到纯的DNA修饰探针或RNA 修饰探针。 [0004]液相氨基活化酯加成法， 需要在DNA 或者RNA上合成氨基结构 （NH2） ， 同时需要修饰 染料为琥珀酰亚胺活化酯结构， 见下反应式中化合物 （1） ， 这种活化酯结构， 相比较亚磷酰 胺结构， 容 易合成。 [0005] [0006]液相氨基活化酯加成法的具体操作的方案如下： [0007]（1） 将20umol含有氨基结构的DNA/RNA溶解于20mlpH为8.5的0.5M  Na2CO3/NaHCO3  缓冲液中， 充分震荡混匀。 [0008]（2） 用7.5mlDMF溶剂去溶解60umol琥珀 酰亚胺活化酯修饰染料固体， 并加入至上 述缓冲液中， 室温震荡混匀。 [0009]（3） 将上述溶 液放入摇床， 室温震荡4 ‑12小时。 [0010]（4） 在上述溶液中加入72ml ‑20℃冷冻酒精沉淀， ‑20℃冷冻30分钟出现絮状， 8000rpm高速 离心， 去除上清液， 取沉淀 。 [0011]（5） 分别用72ml   ‑20℃冷冻酒精清洗沉淀3遍， 并将沉淀烘干， 得DNA/RNA修饰探针 粗品。说　明　书 1/16 页 3 CN 114672482 B 3