(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210715444.8 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 北京林业大 学 地址 100083 北京市海淀区清华 东路35号 (72)发明人 张金凤　黄超　江帅菲　赵健　 范英明　崔莹　包芬　 (74)专利代理 机构 北京元本知识产权代理事务 所(普通合伙) 11308 专利代理师 喻蓉 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/00(2018.01)A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 杂交枫香基因编辑载体、 其构建方法、 及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种杂交枫香基因编辑载体、 其构建方法及其应用方法， 属于植物基因工程技 术领域， 设计2个靶 点， 以AtU3b和AtU3d为两个靶 点的启动子， 经过三轮PCR反应， 构建杂交枫香 PDS基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9 ‑PDS； 将构建 的基因编辑载体转入胚性愈伤组织中并进行了 鉴定， 成功获得基因编辑事件。 本发明建立杂交 枫香基因编辑载体， 对杂交枫香植物基因进行精 确编辑， 产生PDS基因的碱基缺失或替换， 基因编 辑效率高， 本发明的在杂交枫香中能高效、 多靶 点基因编辑的基因编辑载体极大地促进杂交枫 香植物基因功能研究及性状改良。 权利要求书2页 说明书18页 序列表6页 附图4页 CN 114875064 A 2022.08.09 CN 114875064 A 1.一种杂交枫香 植物基因编辑载体的构建方法， 其特 征是， 包括如下步骤： A、 从野生型杂交枫香胚性愈伤组织中克隆PDS基因部分序列， 确定克隆得到的序列包 括PDS基因第一外 显子序列； B、 根据PDS目的基因设计两个靶点： PDS1、 PDS2， 其中PDS1、 PDS2序列分别为： SEQ  ID  NO.5， SEQ ID NO.6； C、 选择以拟南芥AtU3b和AtU3d为两个靶点的启动子， 设计3个靶点接头引 物； 并合成2 个Overlap ping PCR引物对； D、 以质粒pYLgRNA ‑AtU3b为模板， 以2个引物对U ‑F/gR‑R； Guide1 ‑PDS‑gRT/Guide1 ‑ PDS‑U3b， 进行第一轮的Overlapping  PCR反应， 将质粒上的AtU3b启动子与sgRNA序列、 靶点 序列相连， 获得第一轮PCR产物P DS‑AtU3b‑sgRNA； 以质粒pYLgRNA‑AtU3d‑LacZ为模板， 以2个引物对U ‑F/gR‑R； Guide2 ‑PDS‑gRT/Guide2 ‑ PDS‑U3d， 进行第一轮的Overlapping  PCR反应， 将质粒上的AtU3d启动子与sgRNA序列、 靶点 序列相连， 获得第一轮PCR产物P DS‑AtU3d‑sgRNA； E、 以PDS‑AtU3b‑sgRNA为模板， 以Pps ‑GGL、 Pgs‑GG2为引物， 进行第二轮PCR反应， 获得 第二轮PCR的连接产物 AtU3b‑PDS1‑sgRNA‑Bsa I； 以PDS‑AtU3d‑sgRNA为模板， 以Pps ‑GG2、 Pgs‑GGR为引物， 进行第二轮PCR反应， 获得第 二轮PCR的连接产物LacZ ‑AtU3d‑PDS2‑sgRNA‑Bsa I； F、 采用Golden  Gate cloning方法， 将第二轮PCR反应产物与质粒pYLCRISPR/Cas9进行 酶切连接反应， 即第三轮PCR反应， 获得构建完整pYLCRIS PR/Cas9‑PDS载体。 2.如权利 要求1所述的构 建方法， 其特征是， 步骤D)中所述引物对U ‑F/gR‑R的序列分别 为SEQ ID NO.7； SEQ ID NO.8。 3.如权利要求1或2所述的构建方法， 其特征是， 步骤E)中所述引物Pps ‑GGL、 Pgs‑GG2的 序列为SEQ  ID NO.9、 SEQ  ID NO.10； 所述引物Pps ‑GG2、 Pgs‑GGR的序列为SEQ  ID NO.11、 SEQ ID NO.12。 4.如权利要求1或2所述的构建方法， 其特征是， 还包括步骤G)， 将第三轮PCR反应产物 构建完整的pYLCRISPR/Cas9 ‑PDS载体转化到大肠杆菌T1中， 获得阳性菌落； 接着对阳性菌 落进行培 养， 并提取质粒， 获得扩大量的杂交枫香 植物基因编辑载体pYLCRIS PR/Cas9‑PDS。 5.一种杂交枫香植物基因编辑载体， 其特征是按照如权利要求1 ‑4任一所述方法构建 而成。 6.如权利要求5所述杂交枫香植物基因编 辑载体在杂交枫香植物中进行基因编 辑的应 用， 其特征是， 包括如下步骤： 1)将构建的杂交枫香植物基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9 ‑PD转化到农杆菌； 然后对杂 交枫香植物的胚性愈伤组织进行浸染处 理， 获得浸染愈伤组织； 2)将浸染愈伤组织 转移至恢复培 养基中， 进行恢复培 养， 获得恢复培 养胚性愈伤组织； 3)将恢复培养胚性愈伤组织转移至筛选培养基中， 进行筛选培养， 每3周更换一次筛选 培养基， 筛选获得抗 性胚性组织； 4)将抗性胚性组织转移至成熟培养基 中， 进行成熟培养， 获得成熟子叶体胚； 然后移入 萌发培养基中进行 萌发培养， 获得抗 性植株。 7.如权利要求6所述的应用， 其特征是， 步骤1)中所述杂交枫香植物的胚性愈伤组织在权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875064 A 2进行浸染处理之前， 还包括对杂交枫香植物的胚性愈伤组织进行液体增殖培养， 即将杂交 枫香植物的胚性愈伤组织放入液体增殖培养基中， 于23 ±1℃， 黑暗条件下， 振荡培养7 ‑ 10d， 获得增殖的胚性愈伤组织。 8.如权利要求6或7 所述的应用， 其特 征是， 步骤1)中所述浸染处 理包括如下步骤： 1A)将杂交枫香植物的胚性愈伤组织加入到农杆菌浸染液中， 进行浸染处理， 浸染处理 5‑15min后， 抽滤吸干 愈伤组织表面的菌液； 1B)将愈伤组织连同滤纸一同转移到被液体共培养培养基润湿的滤纸上， 于23 ±1℃、 黑暗条件下进行浸染 ‑共培养处理， 获得浸染愈伤组织。 9.如权利要求6或7所述的应用， 其特征是， 步骤2)中所述恢复培养基为： 改良Blaydes 基本培养基+1mg  2,4‑D+0.5mg 6‑BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白+3g/L植物凝胶+ 300mg/LCef， pH调至 5.6～5.7。 10.如权利 要求6或7所述的应用， 其特征是， 步骤3)中所述筛选培养基为： 改良Bl aydes 基本培养基+1mg  2,4‑D+0.5mg 6‑BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白+3g/L植物凝胶+ 300mg/LCef+10mg/LHyg， pH调至 5.6～5.7。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875064 A 3