(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210736644.1 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学第一 附属医院 地址 400037 重庆市沙坪坝区高滩岩3 0号 (72)发明人 徐含青　陈鸣　高铭萱　包静　 刘钱　杨翔　王映然　阳莎　赵爽　 唱凯　汤晓琦　吴显兰　 (74)专利代理 机构 重庆航图知识产权代理事务 所(普通合伙) 50247 专利代理师 王贵君 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 末端双茎锁式探针及其在microRNA检测中 的应用 (57)摘要 本发明公开了末端双茎锁式探针及其在 microRNA 检测中的应用,该锁式探针包 括茎环间 连接序列和分别位于茎环间连接序列5 ’和3’末 端的茎环序列， 所述茎环的部分环状区域和末端 互补区域与目标待测序列互补， 所述茎环间连接 序列可随机设计成需要的功能序列， 实现显色、 靶向等功能。 本发明利用在锁式探针两个末端进 行茎环结构改构， 结合超分支滚环扩增技术或滚 环扩增技术， 从而实现了检测灵敏度和特异性的 双重提高， 并能应用于多靶标的同时检测。 本发 明的探针结构设计和检测方法简单， 耗时短， 成 本低， 易于推广应用， 能灵敏、 特异的进行多靶 标 的同时检测， 并可输出定性、 定量的多种报告信 号。 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图7页 CN 114990193 A 2022.09.02 CN 114990193 A 1.末端双茎锁式探针， 其特征在于： 所述锁式探针包括茎环间连接序列和分别位于茎 环间连接序列5 ’和3’末端的茎环序列， 所述茎环的部 分环状区域和末端互补区域与目标待 测序列互补。 2.根据权利要求1所述末端双茎锁式探针， 其特征在于： 所述茎环间连接序列长度为10 ～100nt； 所述茎环序列的环状区域长度为3～ 25nt， 互补区域的长度为3～15bp。 3.根据权利要求1末端双茎锁式探针， 其特征在于： 所述茎环间连接序列为可随意编辑 的DNA功能区域。 4.根据权利要求2所述末端双茎锁式探针， 其特征在于： 所述功能区域为富含C碱基的 重复序列， 转录后的富含G碱基的重复序列可折叠成G四联体DNA酶催化无色底 物显色。 5.含有权利 要求1～4任一项所述末端双茎锁式探针的microRNA检测试剂盒， 其特征在 于： 包括至少一种所述末端双茎锁式探针， splint  R链接酶， 与所述末端双茎锁式探针的茎 环区域互补的特异引物、 与所述茎环间连接序列的一段碱基序列相同的通用引物、 超分支 滚环扩增试剂或滚环扩增试剂。 6.权利要求1～4任一项所述末端双茎锁式探针在检测至少一个microRNA靶标中的应 用。 7.利用权利要求1～4任一项所述末端双茎锁式探针检测microRNA的方法， 其特征在 于： 将至少一种所述末端双茎锁 式探针加入含有至少一个目标待测microRNA的溶液， 在待 测microRNA打开末端双茎锁式探针两端的茎环后， 使用splint  R链接酶将末端双茎锁式探 针连接成环， 然后利用连接成环的环链作为模板进行超分支滚环扩增， 通过输出荧光信号 检测靶标分子。 或利用连接成环的环链作为模板进行滚环扩增， 通过显色信号检测靶标分 子。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于： 所述连接成环的方法如下： 将末端双茎环 链与待测microRNA、 splint  R连接酶在0.05 ×splintR buffer溶液中2 5℃共孵育1h， 85℃， 20min灭活， 使末端双茎锁式探针有效成环。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于： 所述进行超分支滚环扩增通过输出荧光信 号检测靶标分子方法如下： 向成环的环链中加入特异引物、 通用引物、 dNTPs、 DNA聚合酶、 Super EvaGreen和缓冲液， 使用荧光定量PCR仪在55℃进行荧光的实时监测， 观察指数扩增 曲线的起峰时间； 所述特异引物与末端双茎锁式探针的茎环区域互补， 启动滚换扩增反应形成具有重复 序列的长链； 所述通用引物与茎环间连接序列的一段碱基序列相同， 与滚环扩增形成的重 复序列长链互补并以重复序列长链为模板进行扩增。 10.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于： 所述滚环扩增通过显色信号检测靶标分 子方法如下： 在成环的环链中， 加入特异引物、 dNTPs、 DNA聚合 酶和相应缓冲体系， 在30℃孵 育1h后65℃灭活20min， 获得具有富G序列的重复长链DNA序列， 然后在反应体系中加 入KCl 和TE buffer， 37℃孵育30min形成G四联体， 随后加入hemin， 37℃孵育30min形成G四联体 DNA酶， 再加入TMB显色底 物体系， 37℃孵 育30min可观察到无色的TMB底 物被氧化成蓝色。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990193 A 2末端双茎锁式探针及其在microRNA检测中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学检测领域， 具体涉及末端双茎锁式探针， 还涉及利用末端 双茎锁式探针在microRNA检测中的应用。 背景技术 [0002]microRNA 是一类小的非编码RNA， 在人体的基因转录后调控发挥重要作用， 参与很 多病理生理过程， 与系列疾病的发生、 发展密切相关。 大量研究发现在肿瘤、 心血管疾病、 炎 症等患者的血液和体液中均有micr oRNA的异常表达。 因此被认 为是一种十分有 前景的生物 标志物。 但是由于micr oRNA丰度低， 通常需要进行有效的信号放大才能对其浓度进 行检测。 而且， 单一microRNA对疾病诊疗的特异性差， 通常需要多个靶标联合检测才 能提供有效的 临床诊疗信息， 因此高灵敏度、 多靶标同时检测microRNA的技 术需要被开发和应用。 [0003]为了达到高灵敏度、 高特异性或多靶标同时检测microRNA的目的， 目前大量研究 将多种分子生物学技术联合应用， 或与各种检测平台相结合， 从而实现灵敏度的提高或特 异性的提高或多靶标的同时检测。 然而， 各种技术和平台的联合应用使 得实验设计复杂、 耗 时和成本高昂， 且很少有研究可以同时解决灵敏度、 特异性和多靶标同时检测三个问题。 [0004]因此， 亟待 设计多靶标、 高特异性和高灵敏度的microRNA检测分子探针， 实现简单 和经济的解决灵敏度、 特异性和多靶标同时检测三个问题。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明的目的之一在于提供一种末端双茎锁式探针， 该锁式探针是对 传统锁式探针两个末端进行茎环结构设计的改构， 可以有效地实现灵敏度和特异性的提 升， 且通过超分支滚环扩增的特异 性引物的不同， 可以同时检测不同的micr oRNA分子。 本发 明的目的之二在于提供含有所述末端双茎锁式探针的micr oRNA检测试剂盒； 本发 明的目的 之三在于提供所述末端双茎锁式探针在检测至少一个 microRNA靶标中的应用； 本发 明的目 的之四在于提供利用所述末端双茎锁式探针 检测microRNA的方法。 [0006]为达到上述目的， 本发明提供如下技 术方案： [0007]1、 末端双茎锁式探针， 所述锁式探针包括茎环间连接序列和分别位于茎环间连接 序列5’和3’末端的茎环序列， 所述茎环的部 分环状区域和末端互补区域与目标待测序列互 补。 [0008]本发明优选的， 所述茎环间连接序列长度为10～100nt； 所述茎环序列的环状区域 长度为3～ 25nt， 互补区域的长度为3～15bp。 [0009]本发明优选的， 所述茎环间连接序列为可随意编辑的DNA 功能区域。 [0010]本发明优选的， 所述功能区域富含C碱基 的重复序列， 转录后的富含G碱基 的重复 序列可折叠成G四联体DNA酶催化无色底 物显色。 [0011]2、 含有所述末端双 茎锁式探针的microRNA检测试剂盒， 包括至少一种所述末端双 茎锁式探针， splint  R链接酶， 与所述末端双茎锁式探针的茎环区域互补的特异引物、 与所说　明　书 1/6 页 3 CN 114990193 A 3