(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210758271.8 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 上海海洋大学 地址 201306 上海市浦东 新区沪城环路9 99 号 (72)发明人 祖尧　胡沛男　何宏阳　 (74)专利代理 机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 312 27 专利代理师 曹莉 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/89(2006.01) C12N 15/12(2006.01) A01K 67/027(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法 和应用 (57)摘要 本发明公开了斑马鱼hoxb1a基因缺失突变 体的制备方法和应用， 包括： 确定hoxb1a基因的 敲除靶点位于hoxb1a基因的第1个外显子 上设计 gRNA序列， 以gRNA骨 架质粒为模板进行PCR扩增， 纯化， 体外转录获得gRNA， 将hoxb1a的gRNA与 Cas9蛋白混合共同导入斑马鱼的单细胞期胚胎 中， 培养获得稳定遗传的hoxb1a基因缺失突变 体。 本发明首次利用CRISPR技术在斑马鱼基因组 上进行hoxb1a基因敲除， 实现斑马鱼中hoxb1a基 因的特异敲除， 可作为动物模型用于研究hoxb1a 基因的生物学功能和与hoxb1a基因缺失相关的 疾病。 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图4页 CN 114908098 A 2022.08.16 CN 114908098 A 1.斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法， 其特征在于， 通过CRISPR/Cas9技术制备 斑马鱼hoxb1a基因缺失突变 体， 包括如下步骤： S1、 确定hoxb1a基因敲除的靶点在斑马鱼hoxb1a基因第1个外显子上设计gRNA序列， 其 序列如SEQ  ID NO:1所示； S2、 设计合成hoxb1a  gRNA所需的上游引物T7 ‑hoxb1a‑sfd和下游gRNA反向引物， 序列 分别如SEQ  ID NO:2和SEQ  ID NO:3所示； S3、 以gRNA骨架质粒为模板， 用上游引物T7 ‑hoxb1a‑sfd和下游gRNA反向引物进行PCR 扩增； S4、 对步骤S3的PCR产物进行体外转录获得gRNA， 其序列如SEQ  ID NO:6所示； S5、 将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中； S6、 培养获得稳定遗传的斑马鱼hoxb1a基因突变 体。 2.根据权利 要求1所述的斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法， 其特征在于， 步骤 S5中， 将gRNA与Cas9蛋白混合， 显微注射到斑马鱼一细胞期胚胎中， 其中gRNA终浓度为 100ng/ μL， Cas9蛋白终浓度为80 0ng/ μL， 每枚受精卵注射1n L。 3.根据权利 要求1所述的斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法， 其特征在于， 步骤 S6具体包括如下步骤： A1、 分别取导入gRNA与Cas9蛋白的斑马鱼以及野生型未注射的斑马鱼胚胎进行hoxb1a 基因敲除检测， 确定 hoxb1a基因敲除阳性F0养至成鱼； A2、 将hoxb1a基因敲除阳性F0成鱼与野 生型斑马鱼外交进行可遗传性及有效突变检测， 筛选可遗传的有效突变F1进行喂养 至成鱼； 经基因型鉴定获得hoxb1a  F1突变体斑马鱼； A3、 将相同突变的hoxb1a  F1突变体斑马鱼内交， 获得hoxb1a  F2突变体斑马鱼； A4、 鉴定为F2代中hoxb1a基因敲除的纯合子即为稳定 遗传的斑马鱼hoxb1a基因突变 体。 4.根据权利 要求3所述的斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法， 其特征在于， 步骤 A1中， hoxb1a基因敲除检测采用的引物包括序列如SEQ  ID NO:4所示的上游引物hoxb1a ‑F 和如SEQ ID NO:5所示的下游引物hoxb1a ‑R。 5.根据权利 要求1所述的斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法， 其特征在于， 步骤 S6包括如下步骤： (1)在靶点周围设计引物， 使其距离靶位点两侧 都大于100bp， 且引物距离靶点的距离 之差的绝对值大于100bp； 选择一对健康的WT斑马鱼作为亲本， 剪尾巴进行PCR， 将PCR产物 直接送去测序， 检测亲鱼待敲除的基因是否为纯合子， 要求待注射的成鱼对靶点序列为纯 合子， 如果测序结果显示靶点序列为杂合子， 重新选择待注射的成鱼； (2)将gRNA与Cas9蛋白显微注射入斑马鱼中， 混合注射体系的终浓度gRNA： 100ng/μL； Cas9蛋白： 80 0ng/ μL； 总显微注射体积V＝1n L； (3)注射当天晚上将死卵挑出， 同时换一半新水， 之后每天早晚换水一次， 受精后48h， 双外侧引物PCR检测， 敲除成功F0斑马鱼进行饲养； (4)3‑4个月斑马鱼性成熟后， 将突变的F0斑马鱼与野 生型的斑马鱼杂交， 得到一定概率 的杂合子， 收集胚胎提取基因组， 使用检测引物进 行PCR后， TA克隆送测序确定基因型， 确定 可遗传且发生移码突变的F1斑马鱼进行饲养； (5)经过3 ‑4个月性成熟后， F1突变体斑马鱼成年的雄鱼与雌鱼再次剪尾巴， 进行基因型权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114908098 A 2鉴定筛选， 将突变 体斑马鱼再次交配， 得到斑马鱼hoxb1a基因缺失纯合 突变体。 6.根据权利 要求1至5任一项所述的斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法， 其特征 在于， 所述斑马鱼hoxb1 a基因突变体在4.5dpf时观 察到心包 水肿和心脏环 化异常的心脏畸 形现象， 原位杂交突变 体心房和心室的腔室发育无异常。 7.斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体作为动物模型在研究hoxb1a基因的生物学功能和与 hoxb1a基因缺失相关疾病中的应用， 所述斑马鱼hoxb1 a基因缺失突变体通过权利要求1至6 任一项所述斑马鱼hoxb1a基因缺失突变 体的制备 方法得到 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114908098 A 3