(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210751518.3 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 龙岩学院 地址 364012 福建省龙岩市东肖镇 新罗区 东肖北路1号龙岩学院 (72)发明人 黄翠琴　包银莉　郑灿阳　许洵锴　 陈秋　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 齐宝玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 扩增猫冠状病毒E、 M、 N基因全序列的引物对 及其应用 (57)摘要 本发明公开了扩增猫冠状病毒E、 M、 N基因全 序列的引物对及其应用。 属于分子生物学技术领 域。 用于扩增猫冠状病毒E、 M、 N基因全序列的引 物对， 其核苷酸序列如下： 上游引 物FCoV‑EMN1： TYTTCTCAGGCGGTTMTA； SEQ  ID NO:1； 其中， Y为C 或 T ， M 为 A或 C ； 下 游 引物F C o V ‑E M N 2 ： CAAGGCAGT CTGGTTTCA； SE Q ID NO:2。 本发明通过 一步扩增法， 无需多次扩增、 裁剪， 仅需通过一次 PCR扩增即可实现猫冠状病毒E、 M、 N全基因的扩 增， 操作简便 快捷， 避免单个基因扩增的重复性， 增加了基因扩增的保真性， 并且 克服了因基因变 异导致的目的片段无法扩增的风险。 权利要求书1页 说明书9页 序列表6页 附图3页 CN 115181815 A 2022.10.14 CN 115181815 A 1.一组扩增猫冠状病毒E、 M、 N基因全序列的引物对， 其特 征在于， 其核苷酸序列如下： 上游引物FCoV ‑EMN1： TYTTCTCAGGCGGTTMTA； SEQ ID NO:1； 其中， Y为C或T， M为A或C； 下游引物FCoV ‑EMN2： CAAGGCAGTCTG GTTTCA； SEQ ID NO:2。 2.一种扩增猫冠状病毒E、 M、 N基因全序列的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述 的引物对。 3.一种猫冠状病毒E、 M、 N基因全序列一 步扩增方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)提取病毒RNA； (2)cDNA合成； (3)使用权利要求1所述引物对进行PCR扩增； (4)基因片段检测及测序。 4.如权利要求3所述的方法， 其特 征在于， 步骤(3)中PCR扩增反应 体系为： 其中， 上游引物FCoV ‑EMN1、 下游引物FCoV ‑EMN2的浓度为10pmo l/ μL。 5.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中PCR扩增反应程序为： 95℃预变性 5min； 95℃变性3 0s， 51℃退火3 0s， 72℃延伸5mi n， 设置35个循环； 72℃终延伸10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115181815 A 2扩增猫冠状病毒 E、 M、 N基因 全序列的引物对及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 更具体的说是涉及扩增猫冠状病毒E、 M、 N基因 全序列的引物对及其应用。 背景技术 [0002]猫冠状病毒(Feline  Coronavirus， FCoV)是引起猫冠状病毒病的主要病原， 具有 两种生物型， 分别 为猫肠道冠状病毒(FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。 FECV主要感染 肠道细胞， 通常无症状或引起轻微的肠道症状， 如腹泻、 呕吐等， 偶尔引起严重的肠炎， 致死 率较低。 而FIPV的感染， 则可导致猫腹膜急性、 烈性的炎症反应， 致死率极高。 研究发现， FCoV在猫群中普遍流行， 且传播能力强， 感染率高， 在多猫家庭或流 浪猫收容所等卫生条件 相对较差的环境中较为多发， 严重威胁猫的健康。 [0003]FCoV属于套式病毒目、 冠状病毒科、 冠状病毒属成员， 是有囊膜的单链正股RNA病 毒， 全长29Kb左右， 具有典型的冠状病毒基因组结构， 包括 11个开放阅读 框， 分别编码4个结 构蛋白(S、 E、 M、 N)、 2个非结构蛋白(1a和1b)和5个辅助蛋白(3 a、 3b、 3c、 7a和7b)。 其中， E蛋 白， 即包膜蛋白， 具有可溶性的完整膜蛋白， 其包装RNA基因组形成核衣壳， 在病毒的脱壳、 组装和释放过程中起着重要作用。 M蛋白， 即膜糖蛋， 是病毒 粒子被膜中含量最丰富的蛋白， 它决定了病毒包膜的形状， 并通过与其他结构蛋白的相互作用来指导组装过程， 也被认为 是冠状病毒组装的中心组织者， 与所有其他主要冠状病毒结构蛋白相互作用。 N蛋白， 即核 衣壳蛋白， 是唯一一种主要与冠状病毒RNA基因组结合， 构成核衣壳的蛋白质， 主要功能是 将病毒RNA包装成螺旋状核糖核衣壳(RNP)， 并在病毒 粒子组装过程中与其他结构蛋白相互 作用， 把基因组包裹保护起来。 这三个结构蛋白都与冠状病毒的结构、 组成有着密不可分的 联系， 并在一定程度上决定病毒的致病性， 是FCoV致病作用的主要成分。 因此了解、 掌握 FCoV编码 E、 M、 N蛋白的E、 M、 N基因的变异情况， 有助于了解FCoV的基因重组、 抗原 变异、 病毒 感染细胞机制和基因变化规律， 对FCoV 致病机制的研究和疫苗等防控措施 开发均有重要的 指导意义。 [0004]目前， FCoV的E、 M、 N基因的全序列的获得主要通过设计三对针对猫冠状病毒E、 M、 N 全长基因的引物， 分别对这三个基因进 行扩增、 测序和/或拼接， 从而获得E、 M、 N基因的全长 片段。 该方法不仅存在 “工作量大 ” “耗时长”等问题， 还因为E、 M、 N基因在基因组中相互毗 邻， 存在重复工作的问题。 此外， FCoV作为一种基因组较大的RNA病毒， 不同毒株之间的E、 M、 N基因存在着一定程度的变异， 从而导致该方法在不同毒株之 间存在“无法成功扩增获得目 的片段”的风险。 [0005]综上， 如何提供一种猫冠状病毒E、 M、 N基因全序列一步扩增方法是本领域技术人 员亟需解决的问题。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本 发明提供了扩增猫冠状病毒E、 M、 N基因全序列的引物对及其应用。 猫说　明　书 1/9 页 3 CN 115181815 A 3