(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210954098.9 (22)申请日 2022.08.10 (71)申请人 宁波市农业科 学研究院 地址 315040 浙江省宁波市江东区德厚街 19号 (72)发明人 焦云　王利平　沈颖　 (74)专利代理 机构 江苏斐多律师事务所 323 32 专利代理师 张佳妮 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 快速鉴定蓝莓果型大小的分子标记引物组 合及其应用 (57)摘要 本发明公开了一组快速鉴定蓝莓果型大小 的分子标记引物组合， 所述引物组合包括BS ‑ 23250‑F： 5’ ‑CTTTCTATTCTCGTGTTCTGTAATT ‑3’， BS‑23250‑R： 5’ ‑CCAACCAAA TTATTATTTGAGAA ‑3’。 还公开了上述的分子标记引物组合在快速鉴定 蓝莓是否为中果或小果果型性状上的应用。 本发 明中分子标记引物BS ‑23250扩增产物片段仅为 100bp， 基于蓝莓不同果型群体中基因组DNA中特 异SNP位点开发而成， 稳定性及适用性较好， 鉴定 过程仅需1.5小时； 并且从PCR扩增到最终分型结 果数据的获取为全程闭管操作， 无需再进行后续 凝胶电泳检测， 实现零污染； 样品基因组DNA模板 量仅需10ng即获得分型检测结果。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115181814 A 2022.10.14 CN 115181814 A 1.一组快速鉴定蓝莓果型大小的分子标记引物组合， 其特征在于所述引物组合包括 BS‑23250‑F和BS‑23250‑R， 具体序列为： BS‑23250‑F： 5’ ‑CTTTCTATTCTCGTGT TCTGTAATT‑3’， BS‑23250‑R： 5’ ‑CCAACCAAATTATTATTTGAGAA‑3’。 2.权利要求1所述的分子标记引物组合在快速鉴定蓝莓是否为中果或小果果型性状上 的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特 征在于其 步骤包括： (1)引物合成： 合成权利要求1所述的引物组合BS ‑23250‑F和BS‑23250‑R； (2)DNA的提取： 提取待测蓝 莓样本中的基因 组DNA； (3)PCR扩增： 以上述蓝莓基 因组DNA作为模板， 使用引物BS ‑23250‑F和BS‑23250‑R进行 PCR扩增， 预先加入至少一个已确定蓝莓果型大小性状为中果 或小果的样本基因组DNA作为 内参； (4)扩增产物检测与分析： 使用荧光定量PCR仪进行基因型检测分析， 若有PCR扩增产物 出现且与内参样本聚集为一组者即可视为中果或小果性状类型； 若没有任何PCR扩增产物 出现者视为 其他类型。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述步骤(3)中PCR扩增的体系为： 20n g/ μL 的样本基因组DNA模板1.0 μL， 2 ×SG Fast qPCR Master Mix 5 μL， 10 μM的BS ‑23250‑F引物 0.5 μL， 10 μM的BS ‑23250‑R引物0.5 μL， ddH2O补足至10 μL； 扩增PCR程序如下： 95℃3min， 然后 运行32个 循环反应， 每 个循环为95℃3s， 6 0℃30s。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115181814 A 2快速鉴定蓝 莓果型大小的分子标记引物组合及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 一组快速鉴定蓝莓果型大小的分子标记引物组合及 其应用， 属于分子 生物学领域。 背景技术 [0002]蓝莓(Vaccinium  spp.)为杜鹃花科(Er icaceae)越桔属(Vaccinium)小浆果果树， 原产于北美地区， 在我国境内东北、 西北和华东等地山区均有分布。 由于我国在蓝莓品种选 育及栽培上起步较晚， 在生产上 的栽培品种仍然以欧美等国家选育的品种为主， 主要分为 高丛蓝莓、 矮丛蓝莓和兔眼蓝莓三大类群， 其种质资源遗传背景差异较大。 蓝莓品种繁多， 不同品种之间果实的大小、 形状、 果实风味和成熟期等影响果实品质的指标均不相同。 其 中， 蓝莓果 实的大小对蓝莓采收与销售均有重要影响， 若蓝莓的果 实偏小， 人工采收比较费 工； 而大果型蓝莓果有利于采收， 同时也有助于降低采收成本。 从消费偏好来看， 消费者偏 向于购买大果型的蓝莓果 实。 因此， 选育出品质优的大果型蓝莓优良品种， 可以有效提高其 生产经济效益。 [0003]由于蓝莓为木本植物， 传统的杂交育种需要较长年限， 人工杂交、 育苗、 果实成熟 后进行子代选择、 品系繁殖检测、 品种鉴定等过程需要10年以上才能培育成一个新的品种。 令人欣慰的是， 遗传标记的出现及发展使育种学家 开始应用分子标记辅助育种来提高育种 效率。 然而， 分子标记的应用在蓝莓中大部分是关于遗传多样性分析、 品种鉴定等方面， 而 关于分子标记辅助育种 方面研究报道很少， 尚处于探索阶段。 本发明利用与蓝莓果实大小 形态相关的特异DNA分子标记， 可以在短时间内对蓝莓育种 材料的果实大小形态进行早期 鉴定， 从而可以大大加速育种的进程。 本发明中的蓝莓果实大小形态性状特异位点是经过 蓝莓主栽品种与优株群体DNA重测序结果， 并展开全基因组关联分析获得， 最后经过蓝莓自 然群体验证， 其 鉴定准确性较为可靠 。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一组可用于快速鉴定蓝莓果型大小性状的分子标记引物组 合。 [0005]为达到上述目的， 本发明采用的技术方案为： 一组快速鉴定蓝莓果型大小性状的 分子标记引物组合， 包括BS ‑23250‑F和BS‑23250‑R， 具体序列为： [0006]BS‑23250‑F： 5’ ‑CTTTCTATTCTCGTGT TCTGTAATT‑3’， [0007]BS‑23250‑R： 5’ ‑CCAACCAAATTATTATTTGAGAA‑3’。 [0008]本发明还公开了上述的分子标记引物组合在快速鉴定蓝莓果实大小形态性状中 的应用。 [0009]其步骤包括： [0010](1)引物合成： 合成权利要求1所述的引物BS ‑23250； [0011](2)DNA的提取： 提取蓝 莓叶片的基因 组DNA；说　明　书 1/4 页 3 CN 115181814 A 3