(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210854147.1 (22)申请日 2022.07.20 (71)申请人 江苏农林职业 技术学院 地址 212400 江苏省镇江市句容市文昌东 路19号 (72)发明人 庄林林　杨剑波　朱孟玲　施一成　 申秋平　吴井生　宋春雷　孙丽　 谢海强　赵彬　任希艳　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 曹坤 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种快速检测猪繁殖与 呼吸 综合征病毒的引物、 试剂盒及方法。 属于分子生 物学检测技术等技术领域， 本发 明所述的检测试 剂盒由病毒核酸快速扩增试剂组成。 病毒核酸快 速扩增试剂 包括反应缓冲液、 猪繁殖与呼吸综合 征病毒M基因快速扩增引物和质控品。 利用荧光 定量PCR仪， 本方法可在35分钟内一步法完成猪 繁殖与呼吸综合征病毒快速荧光检测。 本发明猪 繁殖与呼吸综合征病毒检测方法操作简单、 安 全， 无需单独的反转录步骤， 灵敏度高、 特异性 强、 重复性 好， 有利于实际应用。 权利要求书1页 说明书8页 附图5页 CN 115232888 A 2022.10.25 CN 115232888 A 1.快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增引物， 其特 征在于， 所述快速的扩增引物是基于猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因特异性保守区域设计的； 包括正向引物F和反向引物R， 所述正向引物F为M ‑F序列， 如SEQ  ID NO： 1所示， 所述反 向引物R为M ‑R序列， 如SEQ  ID NO： 2。 2.根据权利要求1所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增引物， 其特 征在于， 所述正向引物F、 反向引物R的浓度为0.1 ‑50 μM； 所述正向引物F、 反向引物R的摩尔比为1： 1 ‑1： 2。 3.快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒包括权利要求1 ‑2任一项所述的扩增引物。 4.根据权利要求3所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还包括含有石墨烯的扩增缓冲液、 Bst  DNA聚合酶、 dNTPs、 聚乙二醇、 甜菜 碱、 无酶水、 阳性对照和阴性对照。 5.根据权利要求 4所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒， 其特 征在于， 所述石墨烯包括但不限于氧化石墨烯、 还原石墨烯、 石墨烯纳米片、 石墨烯量子点、 磁 性石墨烯以及官能团修饰石墨烯。 6.快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法， 其特 征在于， 所述检测方法是利用权利要求1 ‑2任一项所述的扩增引物或权利要求3 ‑5任一项所述 的试剂盒， 采用荧 光检测方法结合溶解曲线分析进行检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。 7.根据权利要求6所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病 毒的检测方法， 其特征在于， 所述荧光检测方法是： 将反应液中加 入核酸荧光染料， 其包括但不限于SYB R Green I、 Eva  Green、 SYTO 9。 8.根据权利要求6所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法， 其特 征在于， 其检测步骤具体如下所述： 在待测液中加入权利要求1 ‑2任一项所述的扩增引物或权 利要求3‑5任一项所述的试剂盒及核酸荧光染料， 采用荧光定量PCR仪进行扩增分析， 当反 应结束后荧光曲线起峰， 即荧光值＞0.0001时， 且熔解温度范围为72～76℃时出现熔解曲 线峰， 即导数值＞30时， 判定为阳性； 当反应结束后荧光曲线未起峰， 即荧光值≤0.0001时， 且熔解温度范围为72 ～76℃时未 出现熔解曲线峰， 即导数值＜3 0时， 判定为阴性； 其中， 所述的荧 光值是终点 荧光值减去起 点荧光值。 9.根据权利要求3 ‑8任一项所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病 毒的试剂 盒及其检 测方法， 其特 征在于， 所述快速的扩增引物的反应温度为两步温度快速循环， 其第一步温度为辅助变性温 度， 范围在73～75℃之间， 第二步温度为扩增反应温度， 范围在58～64℃之间， 且每步温度 反应时间为1～10秒； 所述引物的反应温度为第一步温度74～75℃， 第二步温度60～61℃,每步温度反应时 间为1～3秒， 循环总数3 0～50。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115232888 A 2快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 的引物、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检测技术等技术领域， 涉及了一种快速检测猪繁殖与呼吸 综合征病毒的引物、 试剂盒及方法； 具体的是， 涉及了一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病 毒的扩增引物、 其检测试剂盒及方法。 背景技术 [0002]猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine  reproductive  and  respiratory  syndrome  virus， PRRSV)引起的猪的生殖和呼吸系统综合征。 该病以母猪发 热、 厌食、 流产、 死产、 产木乃伊胎、 弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特 征。 PRRSV呈世界性传播， 已成为危害全球养猪业的主要疫病之一。 PRRSV属于动脉炎病毒 属， 其基因组全长约15kb， 为单股 正链、 不分节段的RNA。 不同地域的分离毒株的序列分析表 明， PRRSV有2种基因型， 即以VR2332毒株为代表的美洲型和以Lelystad  virus(LV)为代表 的欧洲型。 2006年开始流行高致病性PRRSV(HP ‑PRRSV)， 其特征是病毒Nsp2蛋白上出现30个 氨基酸不连续缺失。 我国主要流行美洲型毒株， 但近几年欧洲型毒株也 陆续在我国多个省 份被检出。 PRRSV具有超强的变异能力， 形成了多种变异毒株循环 流行的复杂局面。 同时， 我 国主要使用高致病性毒株的弱毒疫苗来防控猪繁殖与呼吸综合征病毒感染， 但该疫苗对当 前主要流行毒株的保护力有限， 导致疫苗毒株与流行毒株以及流行毒株之 间常发生重组事 件， 致使田间毒株复杂多变， 混合感染严重， 对PRRSV的鉴定和防控带来了极大挑战。 此外， 近年来， 猪蓝耳病疫情愈演愈烈， 并有变异株毒力增强的趋势。 因此， 临床上迫切需要提高 实验室诊断PR RSV的能力。 [0003]目前， 国内外检测猪繁殖与呼吸综合征病毒方法主要有以下几种： (1)病毒 分离鉴 定结合红细胞吸 附试验。 该方法结果准确， 但操作烦琐、 耗费时间长， 且只能检测样本中具 有感染能力的病毒颗粒， 因此灵敏度不 足， 不利于感染的早期诊断。 (2)免疫 学检测方法。 以 免疫层析试纸条法和酶联免疫吸 附试验为代表的免疫学检测方法也是目前实验室检测常 用的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法， 但该方法具有滞后性， 灵敏度和特异性也有待提 高。 (3)病毒核酸检测。 应用最为广泛的是聚合酶链 式反应(PCR)技术。 常规PCR检测结果的 判断主要依赖于琼脂糖凝胶电泳， 耗时较长， 且需使用含有一定毒性的核酸 染料等试剂， 操 作安全性有待提高。 实时荧光定量P CR可以对靶标进 行快速定量检测且 无需电泳， 但由于仪 器和试剂成本较高而未能在基层医疗单位和现场检测中广泛使用。 [0004]根据目前已公开的文献或专利中基于核酸扩增的检测技术包括常规PCR、 多重 PCR、 荧光定量PCR、 环介导等温扩增、 重组酶聚合酶扩增及其衍生技术。 这些方法要么检测 所需时间较长或单反应成本较高， 要么对靶序列及长度有一定的要求， 且引物设计有一定 限制。 [0005]因此， 本领域亟需开发一种能够精准检测PRRSV， 且检测时间短、 操作便捷、 灵敏度 高、 特异性强、 准确性好、 成本可控且适于即时检测的病毒核酸检测方法。 这对于有效防控 PRRSV具有极其重要的意 义。说　明　书 1/8 页 3 CN 115232888 A 3