(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210676399.X (22)申请日 2022.06.15 (71)申请人 中国农业科 学院蜜蜂研究所 地址 100093 北京市海淀区香 山北沟1号 (72)发明人 杨卅　邓炎春　侯春生　代平礼　 (74)专利代理 机构 北京惟诚致远知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11536 专利代理师 王慧凤 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD引 物、 方法和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种快速检测东方蜜蜂微孢 子虫(Nosema  ceranae)的RPA ‑LFD引物、 方法和 试剂盒， 该引物序列表中序列3所示的核苷酸和 序列表中序列4所示的核苷酸组成， 该探针序列 如序列表中序列5所示。 本发明准确性高、 特异性 好、 重复性好、 可以准确、 快速地进行检测， 反应 结果易于观察， 通过试纸条的红色条带即可判 读； 灵敏度高； 特异性好， 适用于蜂场的现场检测 等， 具有极高的应用价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 115029463 A 2022.09.09 CN 115029463 A 1.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA ‑LFD引物， 由正向引物和反向引物组成， 所述 正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示， 所述反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所 示。 2.根据权利要求1所述的RPA ‑LFD引物， 其特征在于， 所述的反向引物的5 ′端用生物素 Biotin标记。 3.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA ‑LFD探针， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5所 示。 4.根据权利要求3所述的RPA ‑LFD探针， 其特征在于， 探针的5 ’端标记了FAM或FITC荧光 基团， 3’端用C3Spacer封闭。 5.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA ‑LFD试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒中包含权 利要求1或2所述的RPA ‑LFD引物和权利要求3或4所述的RPA ‑LFD探针。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒中还含有浓度为280mM的醋酸 镁溶液和反应缓冲液 Rehydration  Buffer、 拥挤剂Carbowax  20M、 dNTPs、 ATP、 磷酸肌酸、 肌 酸激酶、 重组酶蛋白、 单链结合蛋白、 DNA聚合酶和RPA ‑LFD核酸检测试纸条。 7.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA ‑LFD方法， 其特 征在于， 包 含以下步骤： 1)提取样本核酸； 2)以提取的核酸为模板， 用权利要求1或2所述的引物， 以及权利要求3或4所述探针进 行RPA反应； 3)将上述反应得到的RPA反应产物用无菌水稀释， 得到稀释液； 4)将稀释液滴在RPA ‑LFD核酸检测试纸条上， 确定样品中是否含有东方蜜蜂微孢子虫； 其中， RPA ‑LFD核酸检测试纸条可检测RPA反应产物是否携带荧光标记和生物素Biotin标 记。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于： 步骤(2)中的RPA反应体系为： Rehydration   Buffer 29.5uL， 2 0umol/L的权利要求1或2所述的RPA ‑LFD引物中的正向引物和反向引物各 2.1uL， 10umol/L的权利要求3或4所述的RPA ‑LFD探针0.6uL， 样本核酸2.0uL， 280mM醋酸镁 2.5uL， H2O补至50uL。 9.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中的RPA反应条件为： 39 ‑42℃反应 20‑30min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029463 A 2快速检测东方蜜蜂微孢 子虫的RPA‑LFD引物、 方 法和试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体而言， 本发明涉及一种快速检测东方蜜蜂微孢子 虫的RPA‑LFD引物、 方法和试剂盒。 背景技术 [0002]东方蜜蜂微孢子虫病的病原属于微孢子虫科(Nosematidae)微孢子虫属(Nosema) 的成员， 被命名为东方蜜蜂微孢子虫。 东方蜜蜂微孢子虫属于单细胞真核生物， 不能在宿 主 细胞外繁殖， 没有经典的线粒体， 但携带有由线粒体衍生的细胞器， 称为线粒体残迹， 通过 利用宿主的能量物质完成自身的快速繁殖。 东方蜜蜂微孢子虫具有感染蜂种多、 范围广的 特点。 [0003]对蜜蜂孢子虫病病原的检测方法有， 通过拉取蜜蜂中肠， 然后用普通光学显和相 差显微镜观 察孢子虫(根据 孢子大小)， 以超微结构中的极丝的螺旋数、 直径和孢子大小。 用 流式细胞仪定量检测活性孢子； 用普通PCR和qPCR检测感染率。 在养蜂生产中， 根据观察蜜 蜂感染后的中肠的病变形态等临床症状及用光学显微镜方法诊断， 结果均相对滞后且不可 靠、 检测率低； 电镜鉴定方法需要较高的专门操作技术和精密仪器， PCR检测也需要昂贵的 仪器且检测的时间较长。 现有的东方蜜蜂微孢子虫检测方法由于上述缺陷无法满足疫病现 场诊断的需求。 研发适合用于东方蜜蜂微孢子虫现场诊断的技术对于有效控制东方蜜蜂微 孢子虫流行 具有重要意 义。 [0004]重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种很有前途的等温核酸扩增技术， 它依赖于重组酶， 单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶 的组合， 在37到42℃的恒定温度下进行20～30min的DNA 扩增。 该技术依赖重组酶介导引物与目标片段序列结合， 使核酸扩增反应脱离了传统P CR反 应必须经历的变性、 退火和延伸的热循环步骤， 进一步触发聚合酶对目标片段进行指数扩 增。 最佳反应温度在37℃ ‑42℃， 反应速度快， 10 ‑20分钟即可获得可检出水平的扩增产物。 针对RPA扩增产物的检测， 实时荧光RPA可对扩增反应进程实时监控， 但需要 能激发并检测 荧光基团的恒温仪器， 比如可控温酶标仪或荧光P CR仪； 相比而言， 试纸条RPA对硬件 条件要 求更低， 只需完成控温扩增反应， 随后通过侧向流层析试纸条读取试验结果。 因此， 试纸条 RPA更适合于现场检测的应用。 目前， 东方蜜蜂微孢子虫检测过程对仪器设备具有依赖性， 且无法做到现场快速检测。 因此， 建立一种 快速可靠的诊断方法对东方蜜蜂微孢子虫 的预 防和控制具有重要的意 义。 发明内容 [0005]本发明的主要目的在于提供一种能够实现现场快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA 核酸等温扩增引物。 [0006]本发明还提供了含有上述快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA恒温扩增引物的试剂 盒。 [0007]为了实现上述目的， 本发明采用了以下技 术手段：说　明　书 1/6 页 3 CN 115029463 A 3