(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210579115.5 (22)申请日 2022.05.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114752710 A (43)申请公布日 2022.07.15 (73)专利权人 中国农业科 学院都市农业研究所 地址 610000 四川省成 都市天府新区湖畔 路北段366号1栋1单 元3层301号房 (72)发明人 王琦　齐晓兰　郑海学　曹丽艳　 冯涛　施磊　袁聪　孔祥雨　 (74)专利代理 机构 郑州大通专利商标代理有限 公司 41111 专利代理师 蔡少华 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/113(2010.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (56)对比文件 CN 107630109 A,2018.01.26 CN 113846181 A,2021.12.28 CN 110129485 A,2019.08.16 WO 2022051667 A1,202 2.03.10 CN 110468155 A,2019.1 1.19 CN 112029908 A,2020.12.04 CN 111500791 A,2020.08.07 Caitlin E. Edwards等. “Swine acute diarrhea syndrome coro navirus repl ication in primary human cel ls reveals potential susceptibi lity to i nfection”. 《PNAS 》 .2020, 审查员 陈小燕 (54)发明名称 快速可视化检测SADS-CoV的crRNA、 试剂盒 及方法 (57)摘要 本发明属于病原检测技术领域， 公开了基于 CRISPR‑Cas12a系统快速可视化检测SADS ‑CoV的 方法， 包括以下步骤： 以SADS ‑CoV cDNA、 PEDV   cDNA、 TGEV cDNA、 PDCoV  cDNA、 H2O为模板， 用RPA 反应引物对进行RPA反应， 利用特异性引导RNA、 crRNA和荧光淬灭报告探针对RPA反应产物进行 Cas12a可视化酶切反应。 本发明针对SADS ‑CoV N 基因序列上的相对保守区域设计， 特异性好， 可 以从猪腹泻相关的系列冠状病毒中精准地检测 出SADS‑CoV， 灵敏度高可达到单个拷贝级别， 检 测速率高且能实现可视化。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 114752710 B 2022.12.06 CN 114752710 B 1.基于CRISPR ‑Cas12a系统快速可视化检测SADS ‑CoV的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒中包含检测SADS ‑CoV的crRNA、 RPA反应引物对、 特异性引导RNA、 荧光淬灭报告探针、 对 RPA反应产物进行酶切的Cas12a蛋白酶， 所述crRNA的序列如SEQ  ID NO.10所示， 所述RPA反 应引物对的上游引物序列如SEQ  ID NO.2所示、 下游引物序列如SEQ  ID NO.6所示， 所述特 异性引导RNA的序列如SEQ  ID NO.9所示， 所述荧光淬灭报告探针的序列为FAM ‑TTATT‑ BHQ1； 所述快速可视化检测SADS ‑CoV是从SADS ‑CoV、 PEDV、 TGEV和PDCoV四种病 毒中快速非 诊断目的检测出SAD S‑CoV病毒。 2.权利要求1所述的试剂盒在快速可视化非诊断目的检测SAD S‑CoV中的应用。 3.利用权利要求1所述的试剂盒快速可视化非诊断目的检测SADS ‑CoV的方法， 其特征 在于， 包括以下步骤： 以SADS ‑CoV cDNA、 PEDV cDNA、 TGEV  cDNA、 PDCoV  cDNA、 H2O为模板， 用 所述试剂盒中RPA反应引物对进行RPA反应， 利用特异性引导RNA、 crRNA和荧光淬灭报告探 针对RPA反应产物进行Cas12a可视化酶切反应。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752710 B 2快速可视化检测SADS ‑CoV的crRNA、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于病原检测技术领域， 涉及基于CRISPR ‑Cas12a系统快速可视化检测   SADS‑CoV的crRNA、 试剂盒及方法。 背景技术 [0002]猪急性腹泻综合征(Swine  Acute Diarrhea  Syndrome,SADS)是由猪急性腹泻综 合症冠状病毒(Swine  Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS ‑CoV)引起的一种高 致病性的新型消化道传染性疾病， 于2017年首次在我国发现。 SADS ‑CoV主要感染5日龄以下 的新生仔猪， 可导致其急性腹泻、 呕吐、 脱水， 最终死亡， 死亡率达90％， 给 我国养猪业的稳 定发展造成了重大威胁。 另外， 有报道称SADS ‑CoV还能感染其它哺乳动物 来源的细胞系， 包 括人源细胞系， 具有很高的跨物种传播 风险， 甚至可能危害人类生命健康。 [0003]疫病发生后， 建立一种高效快捷灵敏的检测方法来对病毒进行快速诊断， 可以及 时阻止疫情的持续传播， 对疫情防控有非常重要的意义。 当前针对SADS ‑CoV的检测方法主 要包括ELISA、 RT ‑LAMP以及基于TaqMan、 SYBR  Green的RT ‑PCR等方法， 这些方法均需要专业 人员和特定 设备， 检测周期 长、 成本高， 对于基层养殖场检测存在一定的局限性。 因此， 需要 开发一种便捷的检测方法， 以简单、 快速、 灵敏、 特异地获得病毒的检测结果。 [0004]目前基于CRISPR ‑Cas12a系统开发的分子诊断技术已经被广泛应用于新冠病毒、 非洲猪瘟病毒、 猪繁殖与呼吸综合征病毒、 人腺病毒等多种病毒核酸的检测， 该系统只需要 恒温条件即可实现病毒核酸的快速可视化检测。 但还没有将CRISPR ‑Cas12a系统应用于检 测 SADS‑CoV的。 发明内容 [0005]本发明的目的之一在于提供基于CRISPR ‑Cas12a系统快速可视化检测SADS ‑CoV的  crRNA， 特异性 好。 [0006]本发明的目的之二在于提供含有上述crRNA的试剂盒。 [0007]本发明的目的之三在于提供利用上述试剂盒快速可视化检测SADS ‑CoV的方法， 可 以从猪腹泻相关的系列冠状病毒中精准地检测出SADS ‑CoV， 灵敏度高可达到单个拷贝级 别， 检测速率高且能实现可视化。 [0008]为实现上述目的， 本发明采用以下技 术方案： [0009]本发明提供一种基于CRISPR ‑Cas12a系统快速可视化检测SADS ‑CoV的crRNA， 所述 crRNA的序列如SEQ  ID NO.10所示。 [0010]本发明还提供含有上述crRNA的试剂盒， 所述试剂盒中还包含RPA反应引物对、 特 异性引导RNA、 荧 光淬灭报告探针。 [0011]在一个优选地技术方案中， 所述RPA反应引物对的上游引物序列如SEQ  ID NO.2所 示、 下游引物序列如SEQ  ID NO.6所示， 所述特异性引导RNA的序列如SEQ  ID NO.9所示， 所 述荧光淬灭报告探针的序列为FAM ‑TTATT‑BHQ1。说　明　书 1/7 页 3 CN 114752710 B 3