(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210719458.7 (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 山东第一医科 大学 （山东省医学 科 学院） 地址 250117 山东省济南市槐荫区青岛路 6699号 (72)发明人 赵燕　杨海宁　崔亚洲　韩金祥　 邹卉　 (74)专利代理 机构 广东科信启帆知识产权代理 事务所(普通 合伙) 44710 专利代理师 李波 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 应用熔解曲线检测MMACHC基因高频突变的 试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种应用熔解曲线检测 MMACHC基因高频突变的试剂盒， 可以对MMA CHC基 因高频突变位点c.80A>G、 c.217C>T、 c.567dupT、 c.482G>A、 c.658_660delAAG和c.609G>A  6个位 点的突变情况进行检测， 检测成本低， 操作简单， 准确度高， 具有较好的特异性， 能够满足临床筛 查的应用。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图10页 CN 114875134 A 2022.08.09 CN 114875134 A 1.一种用于检测MMACHC基因高频突变的引物对集， 其特征在于， 所述引物对集包括第 一引物对集、 第二引物对集和第三引物对集。 2.根据权利 要求1所述的引物对集， 其特征在于， 所述第一引物对集用于检测MMACHC基 因的c.80A＞G、 c.217C＞T、 c.567dupT突变位点， 包括第一上游引物和第一下游引物、 第二 上游引物和第二下游引物、 第三上游引物和第三下游引物， 核苷酸序列依次如SEQ  ID  NO.1‑SEQ ID NO.6所示。 3.根据权利 要求1所述的引物对集， 其特征在于， 所述第二引物对集用于检测MMACHC基 因的c.482G＞A、 c.658_660delAAG突变位点， 包括第四上游引物和第四下游引物、 第五上游 引物和第五下游引物， 核苷酸序列依次如SEQ  ID NO.7‑SEQ ID NO.10所示。 4.根据权利 要求1所述的引物对集， 其特征在于， 所述第三引物对集用于检测MMACHC基 因的c.609G＞A位点， 包括第六上游引物和第六下游引物， 核苷酸序列依次如SEQ  ID  NO.11‑SEQ ID NO.12所示。 5.根据权利 要求1‑4任一项所述的引物对集， 其特征在于， 每条引物的Tm值独立地为58 ～60℃； 优选地， 所述引物之间的Tm值差异在2℃内。 6.一种应用熔解曲线检测MMACHC基因高频突变的试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒包括权利要求1 ‑5任一项所述的引物对集。 7.根据权利要求6所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒进一步包括扩增反应体系组 分、 质控品。 8.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述扩增反应体系 组分选自FastStart   Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 饱和染料、 PCR扩增缓冲液、 MgCl2和水。 9.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述质控品包括空白质控品、 阴性质控 品； 优选地， 所述空白质控品为无酶水； 所述阴性质控品为未突变的M MACHC基因质粒。 10.权利要求1 ‑5所述的引物对集或权利 要求6‑9所述的试剂盒在制备MMACHC高频突变 检测产品或装置中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875134 A 2应用熔解曲线检测M MACHC基因高频突变的试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种应用熔解曲线检测MMACHC基因高频突变 的试剂盒。 背景技术 [0002]甲基丙二酸血症(MethylmalonicAciduria,MMA)， 也称甲基丙二酸尿症， 是常见的 有机酸代谢病。 甲基丙二酸和甲基枸橼酸等毒性物质异常蓄积， 造成多脏器损伤， 尤其是神 经系统损伤， 严重时常危及生命。 该病属常染色体隐性遗传， 在全球的发病率约为1:48,000 ～1:250000， 在中国的发病率为1/28004,而在山东省的发病率高达1/3920。 该病临床表现 个体差异大， 可表现为多系统受累， 自胎儿时期 至成年时期均可发病， 容易漏诊、 误诊， 基因 检测是临床分型的可靠依据， 早期分子检测 和预防尤为关键 。 [0003]MMA分为单纯型甲基丙二酸血症和甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症两种类 型。 在中国MMA患者中合并型MMA最常见， 合并型MMA包括cb1C、 cb1D及cb1F三种亚型， 其中以 cb1C型为主其编码基因是MMACHC， 其中c.80A>G、 c.217C>T、 c.567dupT、 c.482G>A、 c.658_ 660delAAG和c.609G>A 6个突变位点在临床检出率高， 在MMACHC基因中共覆盖大于80％的突 变。 [0004]目前基因突变常用的检测方法包括： 高通量测序法、 sanger测 序法、 高分辨溶解曲 线法等。 高通量测序法的测序通量大、 覆盖度高， 但是价格昂贵， 操作繁琐， 限制了测序速 度。 sanger测序法作为测序检验金标准， 准确度高， 但对待测基因组质量要求高和过程操作 繁琐、 耗时长。 高分辨率溶解曲线分析(HRM)法通过饱和染料结合于P CR扩增产物， 监控产 物 溶解曲线的变化分析基因突变， 检测灵敏度高， 可检出样品中含量低至1％的突变基因， 操 作简便快速， 使用成本低， 结果准确， 但该方法多用于检测单基因突变， 在多重基因突变检 测产品极少。 [0005]如何建立一种简便、 快速、 经济和准确的合并型甲基丙二酸血症基因高频突变筛 查方法， 为M MA的预防、 辅助临床诊断和预后评估提供技 术支持， 已成为亟 待解决的问题。 发明内容 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]本发明的第一方面， 提供了MMACHC基因高频突变检测引物对集， 所述引物对集包 括第一引物对集、 第二引物对集和第三引物对集。 [0008]在某些实施方式中， 所述第一引物对集用于检测 MMACHC基因的c.80A>G、 c.217C> T、 c.567dupT突变位 点。 [0009]进一步地， 所述第一引 物对集包括第一上游引 物和第一下游引 物、 第二上游引 物 和第二下游引物、 第三上游引物和第三下游引物， 核苷酸序列依次如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID  NO.6所示。 [0010]在某些实施方式中， 所述第二引物对集用于检测 MMACHC基因的c.482G>A、 c.658_说　明　书 1/8 页 3 CN 114875134 A 3