(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210771056.1 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50号 (72)发明人 姜朋　张旭　吴磊　何漪　李畅　 (74)专利代理 机构 江苏圣典律师事务所 32 237 专利代理师 杨文晰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 小麦籽粒硬度主效基因的多重KASP标记引 物组及应用 (57)摘要 本申请公开一组小麦籽粒硬度主效基因的 多重KASP标记引物组及应用， 该引物组由核苷酸 序列如SEQ  ID NO.3所示的引物F3、 核苷酸序列 如SEQ IDNO.4所示的引物F4和核苷酸序列如SEQ   ID NO.5所示的通用引物R1组成； 利用该引物组 进行多重PCR检测， 可以同时对小麦样品中Pina ‑ D1和Pinb ‑D1基因进行检测， 相比普通KASP标记 检测， 效率提升了一倍， 而成本降低了一 半， 有利 于大规模育种筛 选。 权利要求书1页 说明书19页 序列表2页 附图3页 CN 115323070 A 2022.11.11 CN 115323070 A 1. 小麦籽粒硬度主效基因 的多重KASP标记引物 组， 其特征在于， 所述引物组由核苷酸 序列如SEQ  ID NO.3所示的引物F3、 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的引物F4和核苷酸序列 如SEQ ID NO.5所示的通用引物R 1组成。 2.如权利要求1所述引物组在同时检测小麦Pi na‑D1和Pinb‑D1基因中的应用。 3.如权利要求2所述的应用， 其特在于， 具体步骤如下： 以所述引物F3、 引 物F4、 引物R1组成的多重KASP标记引物组对小麦样品进行PCR扩增， 然后对扩增产物进行荧光检测； 如果荧光检测结果为蓝色， 则说明样品小麦的基因型为 Pina‑D1a/Pinb‑D1b, 如果荧光检测结果为红色， 则说明样品小麦的基因型为 Pina‑D1b/ Pinb‑D1a， 如果荧光检测结果为绿色， 则说明样品小麦的基因型为 Pina‑D1a/Pinb‑D1a， 如 果荧光检测结果 为黑色， 则说明样品小麦的基因型为 Pina‑D1b/Pinb‑D1b或空白。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特 征在于， 所述PCR扩增是指： PCR反应体系： 2 ×KASP Master Mix 2.5 μL、 KASP Assay Mix 0.07 μL， 浓度为20  ng/ μL的小麦模板DNA  2.43 μL； 其中， 每100 μL所述KASP  Assay Mix包括： 浓度为100  μM的所述 引物F3 12 μL ， 浓度为100  μM的所述引物F4  12 μL ， 浓度为100  μM的所述引物R1  30 μL, 以 ddH2O补足至5 μL; PCR反应程序为： 94℃  15 min； 94℃  20 s， 61‑55℃ 1 min， 每个循环降低0.6℃， 共10 个循环； 94℃  20 s， 55℃ 1 min， 共26个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115323070 A 2小麦籽粒硬度主 效基因的多重KASP标记引物组及应用 技术领域 [0001]本申请涉及小麦育种领域， 特别是一种与小麦籽粒硬度相关的KASP标记及其应 用。 背景技术 [0002]籽粒硬度是小麦品质评价的重要指标， 可以反应小麦胚乳 的质地， 不仅影响小麦 磨粉工艺， 对润麦加水量、 出粉率、 面粉颗粒大小、 破损淀粉粒数量和食品加工品质也有很 大影响， 同时也是国内外小麦分类和定价的重要影响因素(王乐凯,赵乃新,高春霞. “小麦 主要品质指标及其用法简介 ”， 麦类作物学报,2003,23(1):1； 陈锋， 李根英， 耿洪伟， 夏兰 芹， 夏先春， 何中虎， “小麦籽粒硬度及其分子遗传基础研究回顾与展望 ”中国农业科学， 2005， 38(6)： 1088 ‑1094)。 位于小麦5DS染色体的Proindoline  a(Pina‑D1)与Puroindoline   b(Pinb‑D1)是现有报道中控制籽粒硬度的主效基因， Pina ‑D1与Pinb ‑D1两者均为野生型时 (Pina‑D1a/Pinb ‑D1a)， 籽粒表现为软质， 任一亚基缺失或突变， 籽粒表现为硬质(胡文静， 吴宏亚， 董亚超， 吴迪， 高德荣. “江苏省小麦品种(系)硬度基因分布特点解析 ”， 扬州大学学 报， 2020， 41， DOI： 10.16872/j.cn ki.1671‑4652.2020.0 6.005)。 [0003]分子标记辅助选择育种可在D NA水平针对目标性状进行选择， 不仅结果稳定， 而且 可以在苗期进行选择， 降低表型评价的成本， 提高小麦育种效率。 关于Pina ‑D1与Pinb ‑D1的 STS标记早有报道(Giroux,M.,Morris,C.A  glycine to serine change in puroindoline   b is associated  with wheat grain hardness  and low levels of starch‑surface  friabilin.Theoretical  and Applied Genetics,1997,95,857 ‑864),但现有标记的筛选 效率较低， 基于普通PCR扩增及电泳技术的STS标记单次最多检测96份样 品， 每日通量在几 百份左右， 无法满足大规模育种筛 选的需求。 [0004]KASP(Kompet itive Allele Specific  PCR)标记技术是基于引物末端碱基的特异 匹配对SNP分型， 可对SNP位点进行精准的双等位基因判断， 具有低成本、 高通量的特点， 其 单次扩增通量在万份以上， 且无需电泳扩增， 通过荧光分型可直接获得检测结果， 特别适于 大量样本的分子标记检测， 与育种选择相契合， 在育种中具有广泛应用前景。 Rasheed等成 功开发了Pina ‑D1与Pinb ‑D1的KASP标记(RASHEED  A,WENW,GAO  F,ZHAI S,JIN H,LIU J, GUO Q,ZHANG Y,DREISIGACKER  S,XIA X.Development  and validation  of KASP assays  for genes underpinning  key economic  traits in bread wheat.Theoretical  and  Applied Genetics,2016,129(10):1 ‑18)， 在小麦材料筛选中获得广泛应用(胡文静， 吴宏 亚， 董亚超， 吴迪， 高德荣.江苏省小麦品种(系)硬度基因分布特点解析.扬州大学学报， 2020， 41， DOI： 10.16872/j.cnki.1671 ‑4652.2020.06.005； 王君婵,吴旭江,胡文静,张晓, 张勇,高德荣,别同德,张伯桥.扬麦系 列品种(系)重要性状功能基因的KASP检测.江苏农业 学报,2019,3 5(6):1271 ‑1283)。 [0005]多重PCR能在同一反应体系中一次性鉴定多个基因位点， 大大节约时间和试剂， 更 适宜于育种过程中大规模的筛选(许立奎,潘彬荣,岳高红,梅喜雪,刘永安,张宗宸,周 志说　明　书 1/19 页 3 CN 115323070 A 3