(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210744206.X (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 河南省作物分子 育种研究院 地址 450002 河南省郑州市金 水区花园路 116号 (72)发明人 周正富　秦毛毛　耿胜辉　雷振生　 吴政卿　侯锦娜　车军　 (74)专利代理 机构 南京源点知识产权代理有限 公司 32545 专利代理师 王佳妹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 小麦分子标记5668及其在籽粒硬度改良中 的应用 (57)摘要 本发明公开了一个与小麦籽粒硬度性状相 关的分子标记5668， 以及一组与该分子标记相关 的KASP引物组及其应用， 所述KASP引物组包括： 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的上游引物1， 核 苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示的上游引物2， 核苷 酸序列如SEQ  ID NO.3所示的下游引物3， 其中引 物3为共用引物； 以该KASP引物组为引物， 以待测 小麦基因组为模板进行PCR扩增， 当小麦两条染 色体对应位点碱基均为C时， 小麦籽粒属于高硬 度籽粒表型的CC基因型小麦品种， 当小麦两 条染 色体对应位点碱基均为T时， 小麦籽粒属于低硬 度籽粒表型的T T基因型小麦品种。 权利要求书2页 说明书12页 序列表1页 附图2页 CN 114854902 A 2022.08.05 CN 114854902 A 1.一种检测小麦籽粒硬度的物质， 其特征在于， 所述物质为用于检测小麦基因组中染 色体1B上SEQ  ID No.4所示的分子标记5668的第36位基因型是CC、 TT或CT的成套引物或含 有所述成套引物的检测试剂或试剂盒。 2.根据权利要求1所述的物质， 其特 征在于， 所述成套引物中含有两条 上游引物和一条 下游引物； 所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体1B上SEQ  ID No.4所示序列的第 36位脱氧 核糖核苷 酸及其上游序列进 行设计， 且一条所述上游引物的3 ’末端脱氧核糖核苷酸为T， 另 一条所述上游引物的3 ’末端脱氧核糖核苷酸 为C； 所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体1B上SEQ  ID No.4所示序列的第 36位脱氧 核糖核苷酸的下游序列进行设计。 3.根据权利要求2所述的物质， 其特征在于， 所述成套引物为由SEQ  ID No.1的第22 ‑42 位所示的单链DNA分子或其衍生物、 SEQ  ID No.2的第22 ‑42位所示的单链DNA分子或其衍生 物和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物。 4.根据权利要求3所述的物质， 其特征在于， 所述SEQ  ID No.1的第22 ‑42位所示的单链 DNA分子的衍生物为SEQ  ID No.1的第22 ‑42位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标 签序列A； 所述SEQ  ID No.2的第22 ‑42位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ  ID No.2的第 22‑42位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧 光标签序列B。 5.根据权利要求4所述的物质， 其特征在于， 所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列 FAM， 所述特异荧 光标签序列B为 荧光标签序列H EX。 6.根据权利 要求5所述的物质， 其特征在于， 所述上游引物的序列分别如SEQ  ID No.1、 SEQ ID No.2所示， 所述下游引物的序列如SEQ  ID No.3所示。 7.权利要求1 ‑6任一所述的物质在 如下任一中的应用： (A)鉴定或辅助鉴定小麦 籽粒硬度性状； (B)比较待测小麦 籽粒硬度的高低； (C)选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种； (D)选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种； (E)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦 籽粒硬度高低的产品； (F)制备用于 选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品； (G)制备用于 选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。 8.如下任一方法： 方法A： 一种比较待测小麦 籽粒硬度的方法， 包括如下步骤(A1)或(A 2)： (A1)检测小麦基因组中染色体1B上SEQ  ID No.4所示分子标记的第36位基因型是CC还 是TT还是CT； (A2)按照如下确定所述待测小麦籽粒硬度： 基因组中染色体1B上SEQ  ID No.4所示分 子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体则所述待测小麦籽粒硬度高于基因组中染色 体1B上SEQ  ID No.4所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体或者是T和C的杂 合体的所述待测小麦的籽粒硬度； 方法B： 一种选育或筛选籽粒硬度相对较 高的小麦单株或株系或品系或品种的方法， 包 括如下步骤：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114854902 A 2(B1)检测小麦基因组中染色体1B上SEQ  ID No.4所示分子标记的第36位基因型是CC还 是TT还是CT； (B2)选择基因组中染色体1B上SEQ  ID No.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸 是C的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育， 并在育种各世代选择基因组中染色体1B上S EQ  ID No.4所示的分子标记的第36位脱 氧核糖核苷 酸是C的纯合体的小麦， 最 终获得籽粒硬度 相对较高的小麦单株或株系或品系或品种； 方法C： 一种选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法， 包 括如下步骤： (C1)检测小麦基因组中染色体1B上SEQ  ID No.4所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷 酸是CC还是TT还是CT； (C2)选择基因组中染色体1B上SEQ  ID No.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸 是T的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育， 并在育种各世代选择基因组中染色体1B上S EQ  ID No.4所示的分子标记的第36位脱 氧核糖核苷 酸是T的纯合体的小麦， 最 终获得籽粒硬度 相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 所述(A1)(B1)(C1)具体操作为， 采用权利要求1 ‑6任一所述的检测试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增， 将所扩增的产物进行荧光信号扫描， 对扫描数据进行分析， 然后按照如下确定所述待测小 麦基因中染色体1B上SEQ  ID No.4所示的 的第36位脱氧核糖核苷酸是C C还是TT还是C和T： 若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色， 则所述待测小麦基因组中染 色体1B上SEQ  ID No.4所示的分子标记的第3 6位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体； 若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为黄色， 则所述待测小麦基因组中染 色体1B上SEQ  ID No.4所示的分子标记的第3 6位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体； 若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为绿色， 则所述待测小麦基因组中染 色体1B上SEQ  ID No.4所示的分子标记的第3 6位脱氧核糖核苷酸是C和T的杂合体。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特 征在于， 所述PCR扩增具体为， 引物组组合中以摩尔比计， 所述上游引物1： 所述上游引物2： 所述下游引物＝12： 12： 30； PCR反应程序为： 9 5℃、 15min； 9 5℃、 20s， 65℃655℃、 1min； 94℃、 2 0s， 57℃、 1min， 30个循 环； 37℃、 1mi n。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114854902 A 3