(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210609372.9 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 深圳市萨 米医疗中心 地址 518118 广东省深圳市坪 山区石井街 道金牛西路1号 (72)发明人 赵佳　王建春　赵艳秋　陈为鑫　 (74)专利代理 机构 济南克雷姆专利代理事务所 (普通合伙) 37279 专利代理师 杨婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 小片段DNA的检测方法及检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了小片段DNA的检测方法及检测 试剂盒， 属于基因检测技术领域。 所述检测方法 为： (1)针对目标检测基因， 设计得到特异性正向 引物、 特异性反向引物和探针； 在特异性的正向 引物的5’端连接一段含有延伸阻滞剂的茎环结 构得到茎环引物； 所述探针的5 ’端连接荧光基 团， 3’端连接淬灭基团BHQ； (2)QPCR检测。 所述检 测试剂盒包括针对目标检测基因设计的茎环引 物、 特异性正向引物、 特异性反向引物和探针， 以 及QPCR检测方法所必需的试剂。 本发明的检测方 法， 在单管中即可实现目标片段的检测， 操作简 便、 快速， 灵敏度高， 特异性强， 检测结果准确， 适 用于血清、 血浆等样本的游离DNA的简单快读提 取和SRY性别鉴定 。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 114752665 A 2022.07.15 CN 114752665 A 1.一种小片段DNA的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)引物和探针的设计： 针对目标检测基因， 设计得到特异性正向引物、 特异性反向引 物和探针； 在特异性的正向引物的5 ’端连接一段含有延伸阻滞剂的茎环结构得到茎环引物， 所述 含有延伸阻滞剂的茎环结构的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 其中第11、 13、 15位的碱基 为5－甲基胞嘧啶； SEQ ID NO.1： 5’ ‑AGCCATCCAGCGCGCG GCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCT‑3’； 所述探针的5 ’端连接荧 光基团， 3 ’端连接淬灭基团BHQ； (2)QPCR检测： 提取待检测样品中的小片段DNA， 利用步骤(1)中设计得到的引物和探 针， 利用QP CR检测方法进 行扩增和检测， 根据检测结果， 判断待检测样品中是否含有目标检 测基因。 2.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法， 其特征在于： 所述目标检测基因为人 SRY基因； 所述茎环引物、 特异性正向引物、 特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2～5所示， 其所针对的是40bp的小片段DNA； SEQ ID NO.2： 5’ ‑AGCCATCCAGCGCGCG GCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTCCAGGATAGAGTGA AGCGACCCA‑3’； SEQ ID NO.3： 5’ ‑CACACGATGA ATGCGT‑3’； SEQ ID NO.4： 5’ ‑TCCAGGATAGAGTGA AGCGACCCA‑3’； SEQ ID NO.5： 5’ ‑TAGAGTGA AGC‑3’。 3.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法， 其特征在于： 所述目标检测基因为人 SRY基因； 所述茎环引物、 特异性正向引物、 特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.6～9所示， 其所针对的是62bp的小片段DNA； SEQ ID NO.6： 5’ ‑AGCCATCCAGCGCGCG GCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTAGAGTGA AGCGACCCATGA‑3’； SEQ ID NO.7： 5’ ‑GCCATCTTGCGCCTC‑3’； SEQ ID NO.8： 5’ ‑AGAGTGAAGCGACCCATGA‑3’； SEQ ID NO.9： 5’ ‑TCGTGTGGTCTCG‑3’。 4.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法， 其特征在于： 所述目标检测基因为人 SRY基因； 所述茎环引物、 特异性正向引物、 特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.10～13所示， 其所针对的是84bp的小片段DNA； SEQ ID NO.10： 5’ ‑AGCCATCCAGCGCGCG GCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTGGATAGTAAAATAAGTTTCG‑3’； SEQ ID NO.11： 5’ ‑GAAGCATATGAT TGCATTG‑3’； SEQ ID NO.12： 5’ ‑TGGATAGTAAAATAAGTTTCG‑3’； SEQ ID NO.13： 5’ ‑GCACCTTTCAATTTTGTCG‑3’。 5.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法， 其特征在于： 所述待检测样品为血浆 样本。 6.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法， 其特征在于： 所述QPCR检测的反应体 系为： 2x iTaq Probe QPCR mix， 10 μl； 引物混合物， 浓度为10 μmol/L， 1 μl； 探针， 浓度为10 μ权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114752665 A 2mol/L， 0.5 μl； 碎片化DNA， 5 μl； 水， 3.5 μl； 共20 μl； 所述QPCR检测的反应条件设置为： 95℃3min； 95℃， 20s →50℃， 60s， 10个循环； 95℃， 10s→60℃， 30s， 40个循环。 7.一种小片段DNA的检测试剂盒， 其特征在于： 包括针对目标检测基因设计的茎环引 物、 特异性 正向引物、 特异性反向引物和探针； 以及QPCR检测方法所必需的试剂； 其中， 所述茎环引物， 是在特异性的正向引物 的5’端连接一段含有延伸阻滞剂的茎环 结构而得到的， 所述含有延伸阻滞剂的茎环结构的核苷 酸序列如S EQ ID NO.1所示， 其中第 11、 13、 15位的碱基为5－甲基胞嘧啶； SEQ ID NO.1： 5’ ‑AGCCATCCAGCGCGCG GCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCT‑3’； 所述探针的5 ’端连接荧 光基团， 3 ’端连接淬灭基团BHQ。 8.根据权利要求7所述的小片段DNA的检测试剂盒， 其特征在于： 所述目标检测基因为 人SRY基因； 所述茎环引物、 特异性正向引物、 特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2 ～5所示， 其所针对的是40bp的小片段DNA； SEQ ID NO.2： 5’ ‑AGCCATCCAGCGCGCG GCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTCCAGGATAGAGTGA AGCGACCCA‑3’； SEQ ID NO.3： 5’ ‑CACACGATGA ATGCGT‑3’； SEQ ID NO.4： 5’ ‑TCCAGGATAGAGTGA AGCGACCCA‑3’； SEQ ID NO.5： 5’ ‑TAGAGTGA AGC‑3’； 或所述茎环引物、 特异性正向引物、 特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.6～9所示， 其所针对的是62bp的小片段DNA； SEQ ID NO.6： 5’ ‑AGCCATCCAGCGCGCG GCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTAGAGTGA AGCGACCCATGA‑3’； SEQ ID NO.7： 5’ ‑GCCATCTTGCGCCTC‑3’； SEQ ID NO.8： 5’ ‑AGAGTGAAGCGACCCATGA‑3’； SEQ ID NO.9： 5’ ‑TCGTGTGGTCTCG‑3’； 或所述茎环引物、 特异性正向引物、 特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.10～13所示， 其所针对的是84bp的小片段DNA； SEQ ID NO.10： 5’ ‑AGCCATCCAGCGCGCG GCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTGGATAGTAAAATAAGTTTCG‑3’； SEQ ID NO.11： 5’ ‑GAAGCATATGAT TGCATTG‑3’； SEQ ID NO.12： 5’ ‑TGGATAGTAAAATAAGTTTCG‑3’； SEQ ID NO.13： 5’ ‑GCACCTTTCAATTTTGTCG‑3’。 9.权利要求7或8所述的小片段DNA的检测试剂盒在检测样本中的小片段DNA中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于： 所述样本为血浆样本 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114752665 A 3