(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210655922.0 (22)申请日 2022.06.10 (71)申请人 中国人民解 放军军事科学院军事医 学研究院 地址 100000 北京市海淀区太平路27号 (72)发明人 王升启　韩勇军　刘琪琦　刘丽艳　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 刘桐亚 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 实时荧光PCR鉴别新型冠状病毒变异株的方 法 (57)摘要 本发明涉及基因检测技术领域， 尤其是涉及 实时荧光PCR鉴别新型冠状病毒变异株的方法。 本发明利用TaqMan探针RT ‑PCR技术建立了一种 快速鉴别SARS ‑CoV‑2主要变异株方法， 针对每个 突变位点 设计两种TaqMan ‑MGB探针， 用两种荧光 染料分别标记野生型和突变型探针， 在1个PCR反 应管中同时检测两种基因型。 本发明利用TaqMan 探针RT‑PCR技术建立了一种快速鉴别SARS ‑CoV‑ 2主要变异株方法， 可实现准确、 快速、 廉价的检 测， 及时监测SARS ‑CoV‑2毒株的变异情况， 对传 染源进行追踪溯源， 为动态评估疫苗对变异株的 有效性提供依据。 权利要求书3页 说明书12页 序列表9页 附图3页 CN 115044711 A 2022.09.13 CN 115044711 A 1.用于鉴别SARS ‑CoV‑2靶基因片段变异株的核苷酸探针组， 其特 征在于： 所述核苷酸探针组包括阻断SARS ‑CoV‑2靶基因片段野生株扩增的第一核苷酸探针和 阻断SARS ‑CoV‑2靶基因片段变异型扩增的第二核苷酸探针； 所述第一核苷酸探针的核苷酸序列与野生型靶基因片段完全匹配， 与变异型靶基因片 段在变异位置处发生错配， 所述第二核苷酸探针的核苷酸序列与变异型靶基因片段完全匹 配， 与野生型靶基因片段在变异位置处发生 错配； 所述第一核苷酸探针和第二核苷酸探针具有相同的核苷酸序列通式： (Xm)N(Xn)， 其中N 为变异位置的互补碱基， Xm、 Xn分别表示数量 为m、 n的碱基序列， m、 n 为5～12范围内的整数。 2.根据权利要求1所述的核苷酸探针组， 其特征在于， 所述核苷酸探针在变异位置及其 两侧1～12b p范围内， 至少有1～ 4个核苷酸经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性， 优选地， 所述修饰为锁核酸修饰； 所述核苷 酸探针的3 ’末端经过修饰以淬灭荧光基团、 增加 探针的Tm值或阻断探针在扩增过程中延伸， 优选地， 所述 修饰为BHQ1、 BHQ2或MGB修饰。 3.根据权利要求1所述的核苷酸探针组， 其特征在于， 第 一核苷酸探针和第 二核苷酸探 针的5’端带有不 同的荧光标记， 所述荧光标记选自HEX、 FAM、 CY5、 ROX、 Texas  Red‑X、 CY3、 JOE或TET。 4.根据权利要求1～3任一项所述的核苷酸探针组， 其特征在于， 所述SARS ‑CoV‑2靶基 因片段变异株包括Alpha、 Beta、 Gam ma、 Delta或O micron。 5.根据权利要求4所述的寡核苷酸探针组， 其特征在于， 所述Alpha的突变类型包括 N501Y或HV69 ‑70del； 所述Beta的突变类型包括E484K或K417N； 所述Gamma的突变类型包括 K417T或V1176F； 所述Delta的突变类型包括L452R或T478K； 所述Omicron的突变类型包括 H655Y、 N679K或P681H； 优选地， 用于鉴别N501Y变异的探针组包括探针1和探针2； 所述探针1的核苷酸序列为 CAACCCACTAATGGTG， 所述探针2的核苷酸序列为CA ACCCACTTATGGTG； 优选地， 用于鉴别HV69 ‑70del变异的探针组包括探针3和探针4； 所述探针3的核苷酸序 列为CCATGCTATACATGTCTCTG GG， 所述探针4的核苷酸序列为T TCCATGCTATATCTG GGACC； 优选地， 用于鉴别E484K变异的探针组包括探针5和探针6； 所述探针5的核苷酸序列为 AAACCTTCAACACCA， 所述探针6的核苷酸序列为A AACCTTTAACACCA； 优选地， 用于鉴别K417N变异的探针组包括探针7和探针8； 所述探针7的核苷酸序列为 CAGCAATCTTTCCAG， 所述探针8的核苷酸序列为CAGCA ATATTTCCAG； 优选地， 用于鉴别V1176F变异的探针组包括探针9和探针10； 所述探针9的核苷酸序列 为ATGCTTCAGTTGTAAAC， 所述探针10的核苷酸序列为T TAATGCTTCATTTGTA； 优选地， 用于鉴别L452 R变异的探针组包括探针11和探针12； 所述探针11的核苷酸序列 为ATAATTACCTGTATAGAT， 所述探针12的核苷酸序列为TA ATTACCGGTATAGAT； 优选地， 用于鉴别 T478K变异的探针组包括探针13和探针14； 所述探针13的核苷酸序列 为CGGTAGCACAC CTT， 所述探针14的核苷酸序列为CG GTAGCAAACCTT； 优选地， 用于鉴别H655Y变异的探针组包括探针15和探针16； 所述探针15的核苷酸序列 为TGTTGACATGT TCAG， 所述探针16的核苷酸序列为GT TGACATAT TCAGCC； 优选地， 用于鉴别N679K或P681H变异的探针组包括探针17和探针18； 所述探针17的核 苷酸序列为CTA ATTCTCCTCGGC， 所述探针18的核苷酸序列为CTA AATCTCATCG GC。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115044711 A 26.一种用于鉴别SA RS‑CoV‑2靶基因片段变异株的试剂和/或试剂盒， 其特征在于， 所述 试剂和/或试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的核苷酸探针组中的至少一种、 其他扩增 试剂和/或扩增耗材； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N501Y变异， 所述试剂和/或试剂盒包括探针1 和探针2； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别HV69 ‑70del变异， 所述试剂和/或试剂盒包括 探针3和探针4； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别E484K变异， 所述试剂和/或试剂盒包括探针5 和探针6； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别K417N变异， 所述试剂和/或试剂盒包括探针7 和探针8； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别V 1176F变异， 所述试剂和/或试剂盒包括探针9 和探针10； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别L452 R变异， 所述试剂和/或试剂盒包括探针11 和探针12； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别 T478K变异， 所述试剂和/或试剂盒包括探针13 和探针14； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别H655Y变异， 所述试剂和/或试剂盒包括探针15 和探针16； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N679K或P681H变异， 所述试剂和/或试剂盒包 括探针17和探针18； 优选地， 所述探针与所述其他扩增试剂以单独包装的形式提供， 或者所述探针与所述 其他扩增试剂以混合的单一试剂的形式提供； 优选地， 所述其他扩增试剂包括引物对、 逆转录酶、 DNA聚合酶、 缓冲液、 dNTPs和无菌 水； 进一步可选地， 所述其他扩增试剂为多种时， 以单独包装的方式提供， 或者所述其他扩 增试剂中的至少两种以混合的单一试剂的形式提供； 优选地， 所述试剂和/或试剂盒包括引物Mix、 探针Mix、 缓冲液和RT ‑PCR酶； 优选地， 所述引物对由用于扩增包含所述变异型靶基因片段的变异位置的上游引物和 下游引物组成， 所述引物对与所述核苷酸探针在与靶基因片段结合的结合位点上无重叠或 者部分重 叠； 进一步可选地， 所述上游引物和所述下游引物的摩尔比为1： 1～5， 优选为1： 1。 7.根据权利要求6所述的试剂和/或试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂和/或试剂 盒用于鉴 别N501Y变异， 所述引 物对的核苷酸序列分别如下所示： GTTACTTTCCTTTACAATCATATGGT和 CAAAAGAAAGTACTACTACTCTGTATG GT； 或者， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别HV69 ‑70del变异， 所述引物对的核苷酸序列分别 如下所示： TCT TACCTTTCTTTTCCAATGTTAC和TCAT TAAATGGTAGGACAGGGTT； 或者， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别E484K变异， 所述引物对 的核苷酸序列分别如下 所示： CCGGTARCACAC CTTGTA和CCATATGAT TGTAAAGGAAAGT； 或者， 所述试剂和/或试剂盒用于鉴别K417N变异， 所述引物对 的核苷酸序列分别如下 所示： GTCAGACA AATCGCTCCA和GCCTGTAAAATCATCTG GTA；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115044711 A 3