(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210679408.0 (22)申请日 2022.06.16 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114774411 A (43)申请公布日 2022.07.22 (73)专利权人 序康医疗科技 （苏州） 有限公司 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区 星湖街218号 生物纳米园B7楼 201单元 (72)发明人 任军　高芳芳　张鹏　 (74)专利代理 机构 北京市中咨律师事务所 11247 专利代理师 张莉　黄革生 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12P 19/34(2006.01)C40B 50/06(2006.01) 审查员 陈萍 (54)发明名称 大片段DNA 环化连接方法 (57)摘要 本发明涉及一种大片段DNA环化连接方法及 其在测序文库构建中的应用， 和用于实现所述方 法和应用的环化接头和试剂盒和由此形成的DNA 分子和测序文库。 权利要求书3页 说明书22页 序列表3页 附图3页 CN 114774411 B 2022.10.21 CN 114774411 B 1.一种环化接头， 其特征在于， 所述环化接头由5'磷酸化的寡核苷酸长链和与其互补 的5'磷酸化的寡核苷酸短链组成， 并具有由寡核苷酸短链和与其互补的寡核苷酸长链部分 组成的双链体区和一个突出端， 其中， 所述寡核苷酸长链的5'端第一个碱基为A碱基， 第二个碱基为U碱基， 且其中， 所述环化接 头， 按照寡核苷酸长链的5'至 3'方向， 具有如下 结构： 粘性末端生成区 ‑辅助序列区‑内部连接区， 其中， 内部连接区为用于所述环化接头与靶核酸连接的10至30bp长的双链或至少部分 双链的寡核苷酸， 其中， 辅助 序列区为0bp， 或为10bp至75bp长的单链或双链或部分双链的寡核苷酸， 且 其中， 所述环化接头， 按照 寡核苷酸长链的5'至3'方向， 为具有5'突出端和3'平末端的 双链寡核苷酸， 所述粘性末端生成区由寡核苷酸长链5'最末端的AU二核苷酸组成， 且所述 内部连接区由转 座元件的双链寡核苷酸组成， 或 其中， 所述环化接头， 按照 寡核苷酸长链的5'至3'方向， 为具有5'平末端和3'突出端的 双链寡核苷 酸， 所述粘性末端生成区由寡核苷 酸长链5'最末端的AU二核苷 酸和所述寡核苷 酸短链上与其反向互补的二核苷酸AT组成， 且所述内部连接区包 含单碱基3'T突出端。 2.如权利要求1所述的环化接头， 其特征在于， 所述环化接头包含由所述寡核苷酸短链 与所述寡核苷酸长链的一部分互补形成的至少19bp长的双链体区， 且所述环化接头具有 21bp至50bp长。 3.如权利要求1所述的环化接头， 其特征在于， 所述内部连接区由转座元件的双链寡核 苷酸组成。 4.如权利要求3所述的环化接头， 其特征在于， 所述环化接头， 按照寡核苷酸长链的5' 至3'方向， 为具有5'突出端和3'平末端的双链寡核苷酸， 且其中 所述寡核苷酸长链从5'到 3'方向由AU二核苷酸和转 座元件的转移 链组成； 且 所述寡核苷酸短链从5'到 3'方向由转 座元件的非转移 链组成。 5.如权利 要求4所述的环化接头， 其特征在于， 所述转座元件的转移链具有SEQ ID NO: 3所示的序列， 且所述 转座元件的非转移 链具有SEQ ID NO:4所示的序列。 6.如权利 要求1所述的环化接头， 其特征在于， 所述寡核苷酸长链具有SEQ ID NO: 1的 序列； 且所述寡核苷酸短链具有SEQ ID NO: 2的序列。 7.如权利 要求1所述的环化接头， 其特征在于， 所述寡核苷酸长链具有SEQ ID NO: 5的 生物素化序列； 且所述寡核苷酸短链具有SEQ ID NO: 2的序列。 8.如权利要求1所述的环化接 头， 其特征在于， 所述内部连接区包 含3'T突出端。 9.如权利要求8所述的环化接头， 其特征在于， 所述环化接头， 按照寡核苷酸长链的5' 至3'方向， 为具有5'平末端和 3'突出端的双链寡核苷酸， 其中所述5'平末端具有如下二核 苷酸对： 5'‑ A U ‑3' 3'‑ T A ‑5' ， 且其中所述3'突出端为单碱基3'T突出端。 10.如权利要求1所述的环化接头， 其特征在于， 所述辅助序列区包含选自如下的序列： 索引序列， 锚定位 点、 报告标签、 条 形码序列， 和引物结合 位点。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114774411 B 211.如权利要求1所述的环化接头， 其特征在于， 所述环化接头具有缀合的生物素标记 物。 12.一种DNA 环化连接方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： (i) 在靶DNA片段的两端加上根据权利 要求1所述的环化接头， 以得到带有环化接头的 靶DNA片段， 其中， 所述得到的带有环化接头的靶DNA片段具有以反向末端重复的形式存在于其两 末端的如下二核苷酸对： 5'‑  A U  ‑3' 3'‑  T A  ‑5' ； (ii) 应用尿嘧啶特异性切除试剂， 处理由步骤(i)得到的所述带有环化接头的靶DNA 片段， 以产生两端均含有3'AT粘性末端的DNA片段； (iii) 在允许由步骤(ii)产生的DNA片段环化的条件下， 温育所述DNA片段， 以获得环 化的DNA分子 。 13.如权利 要求12所述的方法， 其特征在于， 在所述步骤(iii)后， 消化未发生环化的线 性DNA分子 。 14.如权利要求12所述的方法， 其特 征在于， 所述 步骤(ii)在20℃至45℃进行。 15.如权利要求12所述的方法， 其特 征在于， 所述尿嘧啶特异性切除试剂为USER酶。 16.如权利要求12所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(i)的所述靶DNA片段具有1kbp ‑ 200kbp长度。 17.如权利要求12所述的方法， 其特 征在于， 所述 步骤(i)包括： (a1) 通过转座酶， 将靶DNA进行片段化并同时在产生的靶DNA片段两端加上所述环化 接头； (b1) 将步骤(a1)产 生的靶DNA片段， 通过链置换反应， 补平末端， 以得到所述带有环化 接头的靶DNA片段。 18.如权利要求17所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(a1)的所述环化接头包含寡核苷 酸长链和寡核苷 酸短链， 且其中所述寡核苷 酸长链具有SEQ  ID NO:5的序列； 所述寡核苷 酸 短链具有SEQ  ID NO:2的序列。 19.如权利要求12所述的方法， 其特 征在于， 所述 步骤(i)包括： (a2) 获取平末端的靶DNA片段， 通过末端转移酶， 添加3'  A尾； (b2) 应用TA尾连接， 将所述环化接头连接到所述靶DNA片段的两端， 以得到所述带有 环化接头的靶DNA片段。 20.如权利要求19所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(a2)的所述环化接头， 按照寡核 苷酸长链的5'至 3'方向， 为具有5'平末端和3'突出端的双链寡核苷酸， 且 其中所述5'平末端具有如下二核苷酸对： 5'‑  A U  ‑3' 3'‑  T A  ‑5' ， 且其中所述3'突出端为单碱基3'T突出端。 21.如权利要求19所述的方法， 其特征在于， 所述平末端的靶DNA片段为通过物理或酶 切打断并经末端修复后得到的平末端靶DNA片段。权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114774411 B 3