(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210792689.0 (22)申请日 2022.07.07 (71)申请人 中国科学院西北生态 环境资源研究 院 地址 730000 甘肃省兰州市城关区东岗西 路318号 申请人 青欧生命科 学高等研究院 (72)发明人 陈生云　邹远强　徐静阳　施一　 吴明辉　 (74)专利代理 机构 南京利丰知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 32256 专利代理师 王锋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 多年冻土微生物DNA样本获取及DNA的提取 和检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种多年冻土微生物DNA样本 获取及DNA的提取和检测方法， 其中采用定点、 不 同深度剖面多层位采样法对青藏高原多年冻土 进行无菌采样； 选取多年冻土样品， 采用阶段升 温法进行解冻获取微生物样本； 加入PBS缓冲液 经振荡‑液氮冻融处理后得到冻融悬浮液； 再依 次经过菌体裂解 ‑抽提‑沉淀‑洗涤和溶解得到 DNA样本， 并对获取的DNA样本进行MDA扩增后提 取到多年冻土微生物的DNA； 并采用荧光法对DNA 进行定量分析。 利用本发明的方案能有效提取到 青藏高原多年冻土微生物总DNA， 尤其是覆盖在 活动层以下多年冻土层的低生物量微生物DNA， 并利于对其进行检测， 为青藏高原多年冻土微生 物宏基因 组测序研究提供技 术支持。 权利要求书2页 说明书13页 附图1页 CN 114958971 A 2022.08.30 CN 114958971 A 1.一种多年冻土微 生物DNA样本获取 方法， 其特 征在于， 主 要包括以下步骤： S1采样： 采用定点、 不同深度剖面多层位采样法对青藏高原多年冻土进行无菌采样， 采 样时保持多年冻土样品始终处于冻结状态和无菌状态； 并于 ‑80℃条件下保存； 所述多年冻 土样品包括活动层样品和多年冻土层样品； S2获取微生物样本： 选取所述活动层样品和/或所述多年冻土层样品， 采用阶段升温法 进行解冻并获取 所述微生物样本； S3微生物样本前处理： 将所述微生物样本分别研磨后， 加入PBS缓冲液经振荡 ‑液氮冻 融处理后得到冻融悬浮液； S4采用改良的CTAB法获取DNA样本： 所述冻融悬浮液依次经过菌体裂解 ‑抽提‑沉淀‑洗 涤和溶解得到DNA样本； S5 电泳检测： 对所述DNA样本进行检测。 2.如权利要求1所述的多年冻土微生物DNA样本获取方法， 其特征在于， S1中， 选取9月 底~10上旬处于最大融深期的青藏高原多年冻土的活动层和多年冻土层， 采用定点、 不同深 度剖面多层位采样法进行无菌采样， 采样时保持多年冻土样品始终处于冻结状态和无菌状 态； 将获取的不同深度所述多年冻土样品分别存储于独立、 无菌容器内， 并于 ‑80℃条件下 保存。 3.如权利要求1所述的多年冻土微生物DNA样本获取方法， 其特征在于， S1中， 所述定 点、 不同深度剖面多层位采样法是依次选 取0~20cm、 20~350cm、 350~500cm、 500~600cm、 600~ 1000cm和1000~1500cm不同深度的活动层和多年冻土层进行采样， 其中深度为0~350cm的样 品为所述活动层样品， 其它深度层的样品为所述多年冻土层样品， 并分别存储于独立、 无菌 容器内。 4.如权利 要求1‑3任一项所述的多年冻土微生物DNA样本获取方法， 其特征在于， S2中， 所述阶段升温法包括将所述活动层样品和/或多年冻土样品从 ‑80℃取出后， 依次经过 ‑50 ℃放置30min‑‑20℃放置 30min‑4℃放置1h ‑常温条件下放置1h 。 5.如权利要求4所述的多年冻土微生物DNA样本获取方法， 其特征在于， S4中， 改良的 CTAB法包括以下步骤： （1） 菌体裂解： 将S3中所述冻融悬浮液进行高速离心后， 弃上清液， 加入TE缓冲液得到 沉淀悬浮液， 再加 入SDS和蛋白酶K中混匀， 再加预热后的CTAB/NaCl溶液再次混匀， 保温得 到裂解样品； （2） 抽提： 在 所述裂解样品中加入等体积的Tris饱和酚： 氯仿： 异戊醇试剂 混匀， 在离心 得到的上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇试剂进行抽提； （3） 沉淀： 在步骤 （2） 抽提后的上清液中加入异丙醇离心处 理； （4） 洗涤和溶解： 将步骤 （3） 的离心后的沉淀物用乙醇洗涤， 晾干后溶于ddH2O或pH 8.0 的TE缓冲液中， 得到所述DNA样本 。 6.如权利要求5所述的多年冻土微生物DNA样本获取方法， 其特征在于， 所述沉淀悬浮 液中加入SDS、 蛋白酶K后混匀并37℃保温1小时， 再加入NaCl溶液和  65℃预热的CTAB/NaCl 溶液混匀后， 6 5℃保温3 0分钟。 7.一种多年冻土微生物DNA提取方法， 其特征在于， 采用如权利要求1 ‑6任一项所述的 多年冻土微生物DNA样本获取方法获取的所述DNA样本或传统的CTAB法获取DNA样本进行权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114958971 A 2MDA扩增； 所述MDA扩增包括将所述DNA样本经纯化后进行样本变性 ‑ MDA扩增‑16S rDNA PCR扩 增， 获得PCR产物。 8.如权利要求7所述的多年冻土微生物DNA提取方法， 其特征在于， 所述DNA样本使用 NucleoSpin胶/PCR产物纯化试剂盒进行纯化； 所述样本变性采用PCR扩增仪进行变性得到 变性产物。 9.如权利要求8所述的多年冻土微生物DNA提取方法， 其特征在于， 所述MDA扩增的MDA 扩增体系包括dNTP、 DTT、 Phi29酶、 BSA和超纯水， 将所述PCR产物进行MDA扩增； 所述MDA扩增 体系中各组分与所述变性产物的体积百分比分别为 dNTP： DTT： Phi29酶： BSA： 变性产物=4： 0 .8： 0 .8~2： 0~0 .2： 5~10； 所述16S  rDNA PCR扩增中， 正向引物（341 ‑F）： 5 '‑ CCTACGGGAGGCAGCAG‑3'； 反向引物 （9 26‑R） ： 5'‑CCGTCAATTCCTTTRAGTTT‑3'。 10.一种多年冻土微生物DNA的检测方法， 将如权利要求1 ‑6任一项所述的多年冻土微 生物DNA样本获取方法获取的DNA样本或/和如权利要求7 ‑9任一项所述的多年冻土微生物 DNA提取方法提取的DNA采用荧 光法进行定量分析。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114958971 A 3