(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210682993.X (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 上海交通大 学医学院附属仁济医院 地址 200001 上海市黄浦区山 东中路145号 (72)发明人 曹泽晖　扶琼　谭蔚泓　吕良敬　 钱金晶　 (74)专利代理 机构 上海洞鉴知识产权代理事务 所(普通合伙) 31346 专利代理师 刘少伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 多型干扰素通路活化的多重定量检测方法 和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了多型干扰素通路活化的检测 的基因组及其对应的引物组， 包括： 扩增IFI44、 MX1、 IRF1以及GBP1基因的引物 。 将检测引物组结 合内参基因HPRT1， 开发了多重检测方法， 可对病 人样品中的基因同时进行精准定量分析， 从而实 现用一个反应就对I/II型干扰素通路进行分型， 并具有较高的特异性和灵敏度。 本发 明开发的检 测方法同时检测四个目标基因， 经临床验证， 其 定量结果与四个基因分开来单独检测的结果高 度吻合， 在保证定量结果可靠性的同时大大提高 检测效率。 结合筛选到的基因的特异性和四重定 量检测的可靠性， 本发明能够精确的鉴别引发自 身免疫性疾病的分子机制和评估病情的发展， 为 临床诊断和精准治 疗提供有效的指导。 权利要求书1页 说明书10页 序列表5页 附图5页 CN 115044654 A 2022.09.13 CN 115044654 A 1.多型干扰素通路活化的检测的基因 组及其对应的引物组， 包括： 1)扩增IFI 44基因的引物； 和 2)任选的扩增MX1基因的引物、 扩增IRF1基因的引物以及扩增GBP1基因的引物； 其特征 在于， 扩增IFI44基因的引物序列分别如SEQ  ID NO:1‑2所示， 扩增MX1基因的引物分别如 SEQ ID NO:4‑5所示， 扩增IRF1基因 的引物分别如SEQ  ID NO:7‑8所示， 扩增GBP 1基因的引 物分别如SEQ  ID NO:17‑18所示。 2.根据权利要求1所述的检测引物组， 其特 征在于， 所述引物组包括： 1)扩增IFI 44基因的引物； 和 2)扩增MX1基因的引物和扩增IRF1基因的引物； 或， 扩增IRF1基因的引物和扩增GBP1基 因的引物。 3.根据权利 要求1‑2任一所述的检测引物组， 其特征在于， 还包括探针， 所述结合IFI44 基因的探针如SEQ  ID NO:3所示， 所述结合MX1基因的探针如SEQ  ID NO:6所示， 所述结合 IRF1基因的探针如SEQ  ID NO:9所示， 所述结合GBP1基因的探针如SEQ  ID NO:19所示。 4.根据权利要求3所述的引物组， 其特 征在于， 所述探针采用荧 光基团标记。 5.根据权利要求4所述的引物 组， 其特征在于， 还包括扩增内参基因的引物， 优选地， 所 述内参基因为HPRT1基因， 所述扩增内参基因的引物序列分别如SEQ  ID NO:10‑11所示。 6.根据权利要5所述的引物组， 其特征在于， 还包括结合内参基因HPRT1的探针， 优选 地， 所述结合内参基因HPRT1的探针序列如SEQ  ID NO:12所示。 7.一种组合物， 其特 征在于， 包括权利要求1 ‑6任一权利要求所述的引物组。 8.一种检测多型干扰素通路活化的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑6任一所述的 引物组或权利要求7 所述的组合物。 9.权利要求1 ‑6任一所述的引物 组和/或权利要求9所述的组合物在制备检测患 者干扰 素分型的试剂中的用途， 优选地， 所述患者所患疾病包括但不限于： 系统性红斑狼疮， 干燥 综合症， 类风湿关节炎， 系统性硬化症， 特发性炎症性肌病等自身免疫性疾病， 自身炎症性 疾病， 病毒感染相关疾病， 各类肿瘤等。 10.权利要求1 ‑6所述引物组的RT ‑qPCR的扩增方法， 其特 征在于， 包括： (1)将权利要求1 ‑8所述的引物组中的引物添加到RT ‑qPCR反应混合液， 建立RT ‑qPCR反 应体系； (2)按照如下条件进行反应： 55℃， 10分钟； 95℃， 1分钟； 45个循环： 95℃， 5秒钟， 60℃， 10秒钟； 具体地， 所述反应 体系中的各引物的浓度分别为0.1 ‑0.01 μM， 优选为0.08 μM 。 优选地， 所述RT ‑qPCR反应体系为： 12.5μL的2倍RT ‑qPCR反应混合液， 1μL逆转录酶， 0.16 μL的10 μM浓度的权利要求1 ‑8所述的引物组中的各个引物， 0.16 μL的10 μM浓度的权利 要求1‑8所述的各基因的探针， 1 μL待测RNA样品， 加适 量纯水到总反应 体积20 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044654 A 2多型干扰素通路活化的多重定量 检测方法和试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及精准检测领域， 具体涉及多型干扰素通路活化的检测引物组及其应 用。 背景技术 [0002]干扰素是重要的免疫调节分子， 其中包括I型(包括IFN ‑α和IFN‑β )和II型(IFN ‑ γ)， 在多种免疫系统参与的疾病中起着关键作用： 在病毒感染的疾病中， 干扰素应答构成 了机体抵御病毒感染的第一道防线， 可以调节几乎所有的固有和适应性免疫应答的效应细 胞。 在多个病毒感染引起的疾病中， 如艾滋病、 肝炎等， 干扰素可用于激活自身免疫反应， 帮 助清除病毒。 在包括由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS ‑CoV‑2)引起的疾病在内的各 种疾病中， 干扰素 可用于监测疾病发生发展及预后评估。 [0003]在癌症中， 干扰素通常起着促进抗肿瘤免疫反应 的有益作用， 同时也被用来评估 免疫系统的活性， 对药物的反应和疗效预测等等。 在脓毒症， COVID ‑19等病症 中， 病人的死 因往往是炎症风暴引起的器官衰竭。 而这其中IFN ‑γ是诱导细胞凋亡的关键细胞因子， 其 大规模过度表达被认为是导致免疫系统过分激活， 引起免疫风暴的主要原因， 最终导致器 官衰竭。 在系统性红斑狼疮(SLE)、 皮肌炎、 类风湿性关节炎等 自身免疫性疾病的发生发展 中， 干扰素相关通路的异常活化起着关键作用。 在不同自身免疫性疾病中， 干扰素通路活化 的类型和程度不同， 例如SLE中存在I型干扰素通路的异常活化。 目前， 自身免疫病治疗的主 要手段还 是用激素、 免疫抑制剂等药物抑制身体的免疫反应。 然而， 这些药物并不能解决发 病的根本原因， 且长期用药有严重的副作用。 目前国外已有针对不同干扰素通路的靶向药 物获批或进入临床末期， 用于治疗自身免疫性疾病。 因此， 对患者的干扰素活化的通路进 行 鉴定和分型是未来的发展方向， 能够精确的指导用药， 实现更精准有效、 副作用更低的治 疗。 同时， 对干扰素通路活化的程度进 行定量分析， 能够实现对自身免疫性疾病病人更有效 的诊断， 对病情发展做出 更准确的评估。 然 而， 目前市场上还缺少 相应的诊断产品。 [0004]对干扰素通路的活化状况进行定量分析能帮助多种疾病实现有效的病情分析， 预 后评估， 用药指导， 疗效监测等等。 目前临床上对包括自身免疫性疾病在内的这类疾病的诊 断主要依靠临床症状和表现， 高度依赖于医生的临床经验并难以实现准确的定量评估。 血 液中产生的特定抗体也常被用来辅助诊断， 但这些抗体与病情发展存在脱节， 往往病 人症 状已经缓解而抗体依然存在。 对干扰素本身的直接检测是目前正在大力发展的临床诊断技 术。 干扰素在血液中含量很低， 它们的微小波动就会产生很大效应， 造成检测困难， 且难以 直接用于病情评估。 另一方面， 干扰素依靠与免疫细胞上 的受体结合并激活细胞内相关通 路来实现其作用； 这些通路 的激活会造成免疫细胞(如PBMC， 外周血单个核细胞)中一系列 下游ISG基因(IFN ‑stimulated  genes， 干扰素诱导基因)的激活和表达上调； 对这些基因表 达的监测， 是 更直接的评估干扰素通路活化状况的手段。 [0005]另一方面， 文献中报导较多的是I型干扰素激活相关的特征基因， 并且用来测量I 型干扰素通路的活化。 II型干扰素相关基因也有报导， 然而这些基因存在的问题包括： 本身说　明　书 1/10 页 3 CN 115044654 A 3