(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210646485.6 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 连云港市第一人民医院 地址 222000 江苏省连云港市海州区振华 东路6号 申请人 北京恩泽康泰生物科技有限公司 (72)发明人 惠开元　蒋晓东　王媛　林海军　 刘纯　胡晨曦　闫冬悦　孙文　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 刘璞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 外泌体RNA在RTK抑制剂治疗晚期非小细胞 肺癌疗效评估中的应用 (57)摘要 本发明涉及生物检测技术领域， 具体涉及外 泌体RNA在RTK抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌疗 效评估中的应用。 本发明所提供的外泌体RNA选 自miR‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p、 PRKAR2B中的至少一 种。 本发明的研究数据表明， 在安罗替尼治疗的 过程中， 存在miRNA和mRNA的失调现象， 且在治疗 有效阶段及无效阶段的上下调趋势相反。 并且， 失调的RNA涉及多个癌症相关通路及生物学过 程， 如前列腺癌通路、 胰腺癌通路、 细胞粘附通 路、 IL‑17通路等。 本发明基于安罗替尼在治疗 过 程中的耐药问题， 探索了评估安罗替尼治疗反应 的生物标志物， 为进一步提高安罗替尼在非小细 胞肺癌中的疗效提供 科学参考。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图11页 CN 114921531 A 2022.08.19 CN 114921531 A 1.外泌体RNA在RTK抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌疗效评估中的应用， 所述外泌体RNA 为miR‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p、 PRKAR2B中的任一种。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述miR ‑34a‑5p的检测引物如SEQ  ID  NO.1‑2所示； 所述miR ‑27b‑5p的检测引物如SEQ  ID NO.3‑4所示； 所述PRKAR2B的检测引物 如SEQ ID NO.5‑6所示。 3.外泌体RNA在制备RTK抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌疗效评估的试剂或试剂盒中的 应用； 所述外泌体RNA为miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p、 PRKAR2B中的任一种。 4.根据权利 要求1‑3任一项所述的应用， 其特征在于， 所述RTK抑制剂为安罗替尼； 所述 晚期非小细胞肺癌包括腺癌、 鳞癌、 大细胞癌中的一种或多种。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 若miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p或PRKAR2B的输 出值低于未接受安罗替尼治疗的对照组输出值， 说明非小细胞肺癌患者在服用安罗替尼治 疗的过程中疗效性 好。 6.用于评估安罗替尼治疗效果 的引物， 其特征在于， 其序列如SEQ  ID NO.1‑2、 SEQ ID  NO.3‑4或SEQ ID NO.5‑6所示。 7.一种试剂 盒， 其特征在于， 用于评估安罗替尼治疗晚期非小细胞肺癌的疗 效； 其含有 用于检测miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p或PRKAR2B表达水平的试剂。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包括如SEQ  ID NO.1‑2、 SEQ ID NO.3‑4或SEQ ID NO.5‑6所示的检测引物； 还包括用于检测内参基因的上、 下游引 物； 优选地， 所述内参基因包括U6和GAP DH。 9.非诊断目的的评估安罗替尼治疗晚期非小细胞肺癌疗效的方法， 其特征在于， 采用 权利要求6所述的引物或权利要求7 ‑8任一项所述的试剂盒检测miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p或 PRKAR2B的表达水平， 并与未接受安罗替尼治疗的对照组进行比较； 优选地， 所述比较为： 利用内参基因对miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p或PRKAR2B的表达水平 进行归一化； 将 归一化后的miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p或PRKAR2B的表达水平值进行逻辑回归 处理得到miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p或PRKAR2B输出值； 将miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p或PRKAR2B 输出值与未接受安罗替尼治疗的对照组输出值进行比较， 若miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p或 PRKAR2B输出值低于对照组输出值， 说明非小细胞肺癌患者在服用安罗替尼治疗的过程中 疗效性好。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特 征在于， 包括： (1)采集待检测对象的体液样本； (2)从步骤(1)的体液样本中提取分离 外泌体； (3)提取外泌体RNA； (4)检测miR ‑34a‑5p、 miR‑27b‑5p或PRKAR2B和内参基 因的表达水平并进行差异表达分 析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921531 A 2外泌体RNA在RTK抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌疗效 评估中的 应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测技术领域， 具体涉及外泌体RNA在RTK抑制剂治疗晚期非小细 胞肺癌疗效评估中的应用。 背景技术 [0002]肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因， 其中非小细胞肺癌占所有肺癌的80％～ 85％， 是最为常见的肺癌类型。 非小细胞肺癌指的是源于支气管黏膜上皮或肺泡上皮的恶 性肿瘤， 根据病理类型可分为腺癌、 鳞癌、 大细胞癌。 在过去的二十年里， 非小细胞肺癌的治 疗取得了重要进展， 主要治疗手段为放疗、 化疗、 靶向治疗、 免疫治疗等。 小分子酪氨酸激酶 抑制剂的使用也为 晚期非小细胞肺癌患者的治疗带来了前所未有的生存益处。 然而， 患者 的总体治愈率和存活率仍然较低， 除了疾病的转移 性外， 安罗替尼的耐药问题 也不容忽视。 因此， 确定可用于评估晚期非小细胞肺癌患者对安罗替尼临床反应的生物标志物是改善临 床结果迫切需要解决的问题。 [0003]受体酪氨酸激酶(RTK)是一种跨膜糖蛋白， 可与细胞生长因子和细胞外配体进行 通信。 RTK激活介导许多重要的生理过程， 包括细胞增殖、 细胞生长、 细胞迁移、 细胞分化和 细胞凋亡等。 此外， RTK与多种病理状况有关， 包括癌症、 自身免疫性疾病、 传染病和神经退 行性疾病等。 迄今为止， 靶向RTK抑制剂已成功用于治疗多种癌症类型。 安罗替尼是一种新 开发的口服小分子RTK靶向血管内皮生长因子受体(VEGFR)、 血小板衍生生长因子受体 (PDGFR)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)等的抑制剂。 与其它RTK抑制剂相比， 安罗替尼 可以抑制更多的靶点。 安罗替尼治疗可延 长接受三线或三线以上治疗的难治性晚期非小细 胞肺癌的中位无进展生存期(PFS)和中位总 生存期(OS)， 其潜在机制可能归因于安罗替尼 诱导的血管生成阻滞。 [0004]一项名为ALTER  0303的多中心、 双盲、 III期的随机临床试验， 评估了安罗替尼在 晚期非小细胞肺癌治疗中的疗效与安全性。 对比安慰剂组患者， 安罗 替尼组的PFS显著增 加， 但OS仅延长3.3个月。 上述试验数据表明， 安罗替尼在临床治疗的过程中不可避免地出 现了耐药现象， 患者总生存期并未得到显著改善， 抗血管生成治疗只起到了 短暂的作用。 也 就是说， 尽管安罗替尼在非小细胞肺癌中具有可观的疗效和可控可耐受的安全性， 但其疗 效及潜在的分子 机制仍有 待充分表征。 [0005]外泌体富含D NA、 RNA、 蛋白质等生物信号， 充当细胞之间的 “信使”， 在肿瘤的发生、 发展中起着重要作用。 目前已有研究证明， 外泌体是潜在的肺癌分子生物标志物。 大量研究 报道了miRNA与mRNA参与肿 瘤的发生发展、 转移、 耐药等过程， 展示了其作为癌症生物标志 物的潜力， 其调节干扰肿瘤免疫和微环境等过程可能会影响肿瘤生长、 侵袭、 血管生成和耐 药性。 此外， 它们以非常稳定和细胞独立的形式存在于人类血浆中， 这使得其作为生理和病 理条件(包括癌症)的新型非侵入性生物标志物且受到越来越多的关注。 鉴于外泌体RNA与 非小细胞肺癌进 展的相关性， 有望作为非小细胞肺癌的疗效评估标志 物。说　明　书 1/11 页 3 CN 114921531 A 3