(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210770266.9 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 重庆海关技 术中心 地址 400700 重庆市北碚区悦复大道 28号 15幢 (72)发明人 聂福平　曹改花　史梅梅　熊亦帆　 侯长军　杨俊　王昱　李应国　 霍丹群　王国民　 (74)专利代理 机构 重庆市恒信知识产权代理有 限公司 5 0102 专利代理师 李金蓉 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒 属分型检测试剂盒及试纸条 试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种基于阵列模式和CRISPR/ Cas12a的羊痘病毒属分型检测试剂盒及试纸条 试剂盒。 首先基于VARV  B22R和RPO  30基因进行 PCR扩增， 扩增产物包含了LSDV、 SPPV和GTPV的特 异性区域。 随后利用CRISPR/Cas12a系统对扩增 产物进行特异性识别。 基于两对引物和3个 CRISPR/Cas12a系统构建荧光阵列模式， 对 LSDV、 SPPV和GTPV进行准确、 特异性地鉴别。 在CRISPR/ Cas12a系统和PCR扩增模式下， 针对 LSDV、 SPPV和 GTPV的实际检测分别低至50copies， 40copies， 60copies。 另外， 采用CRISPR/Cas12a专用试纸条 结合阵列模式实现了对CaPV分型的Point ‑of‑ care检测， 方便养殖户或者企业对病毒的监测和 鉴别。 相比与其他分型的检测方法， 本发明基于 阵列模式可以更加准确和全 面地对LSDV、 SPPV和 GTPV的鉴别， 并具有更高的灵敏度。 权利要求书2页 说明书8页 序列表3页 附图10页 CN 115074466 A 2022.09.20 CN 115074466 A 1.基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属分型检测试剂盒， 其特征在于： 包括两 对引物和三条crRNA序列， 其序列如下 所示： B22R‑Forward引物： 5 ’ ‑CTTTTTCCATGATATG GTGGGC‑3’ B22R‑Reverse引物： 5 ’ ‑TGAATGTGATCTCATATC CTTATTG‑3’ RPO 30‑Forward引物： 5 ’ ‑TCTATGTCT TGATATGTG GTGGTAG‑3’ RPO 30‑Reverse引物： 5 ’ ‑AGTGATTAGGTGGTGTATTATTTTCC‑3’ crRNA1序列： 5 ’ ‑AAUUUCUACUAAGUGUAGAU UAAAAAAAGAAAAAAAAAAAG‑3’ crRNA2序列： 5’ ‑AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUACA AAUAAAUAAAUUGCUU‑3’ crRNA3序列： 5 ’ ‑AAUUUCUACUAAGUGUAGAU UACUGAAGUUGUUUAUUUUCA‑3’。 2.根据权利 要求1所述基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属分型检测试剂盒， 其特征在于： 还包括ddH2O、 2×Ex Taq(Probe  qPCR)MIX、 LbCas12a、 ssDNA ‑FQ reporter和 10×NEB buffer 2.1。 3.根据权利 要求2所述基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属分型检测试剂盒， 其特征在于： 进行羊痘病毒属分型检测时， 包括两个 体系： PCR体系： 2 ×Ex Taq(Probe  qPCR)MIX  12.5 μL,1μL  10 μM B22R‑Forward引物和B22R ‑ Reverse引物、 或者RPO  30‑Forward引物和RPO  30‑Reverse引物， 8.5 μL  ddH2O和2 μL待检样 品； 扩增程序为： 95℃5min； 35个循环： 95℃10s， 55℃15s和72℃15s； 最后， 72℃10min延伸； 分别扩增B2 2R和RPO 30基因； CRISPR/Cas12a体系： 取B22R扩增反应液4μL分别加入到crRNA1和crRNA2的CRISPR/ Cas12a体系中； 取4 μL  RPO 30基因扩增液加入到crRNA3的CRISPR/Cas12a体系中； CRISPR/ Cas12a包含1 μM  LbCas12a  2 μL,1μM crRNA 2 μL,1 μL 10 μM ssDNA‑FQ reporter,2 μL  10× NEB buffer 2.1和9 μL  ddH2O； 所述crRNA 为crRNA1序列、 crRNA2序列或crRNA3序列， 分别构 建包含crRNA1、 crRNA 2、 crRNA3的CRIS PR/Cas12a体系。 4.根据权利 要求3所述基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属分型检测试剂盒， 其特征在于： 采用ssDNA ‑FQ reporter作为信标分子， 最终体系在恒温荧光仪上3 7℃15min， 采集信号； 结果判定如下： crRNA1、 crRNA2和crRNA3体系均有信号为LSDV； 仅有crRNA2有信 号为SPPV； crRNA 2和crRNA3有信号而crRNA1没有信号 为GTPV。 5.权利要求1 ‑4任一项所述基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属 分型检测试 剂盒在制备羊痘病毒属分型检测用品中的应用。 6.基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属分型检测试纸条试剂盒， 包括侧向流 试纸条， 其特 征在于： 还 包括两对引物和三条crRNA序列， 其序列如下 所示： B22R‑Forward引物： 5 ’ ‑CTTTTTCCATGATATG GTGGGC‑3’ B22R‑Reverse引物： 5 ’ ‑TGAATGTGATCTCATATC CTTATTG‑3’ RPO 30‑Forward引物： 5 ’ ‑TCTATGTCT TGATATGTG GTGGTAG‑3’ RPO 30‑Reverse引物： 5 ’ ‑AGTGATTAGGTGGTGTATTATTTTCC‑3’ crRNA1序列： 5 ’ ‑AAUUUCUACUAAGUGUAGAU UAAAAAAAGAAAAAAAAAAAG‑3’ crRNA2序列： 5’ ‑AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUACA AAUAAAUAAAUUGCUU‑3’ crRNA3序列： 5 ’ ‑AAUUUCUACUAAGUGUAGAU UACUGAAGUUGUUUAUUUUCA‑3’。 7.根据权利要求6所述基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属分型检测试纸条权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115074466 A 2试剂盒， 其特征在于： 还包括ddH2O、 2×Ex Taq(Probe  qPCR)MIX、 LbCas12a、 FAM/Bio   reporter和10×NEB buffer 2.1。 8.根据权利要求7所述基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属分型检测试纸条 试剂盒， 其特 征在于： 进行羊痘病毒属分型检测时， 包括两个 体系： PCR体系： 2 ×Ex Taq(Probe  qPCR)MIX  12.5 μL,1μL  10 μM B22R‑Forward引物和B22R ‑ Reverse引物、 或者RPO  30‑Forward引物和RPO  30‑Reverse引物， 8.5 μL  ddH2O和2 μL待检样 品； 扩增程序为： 95℃5min； 35个循环： 95℃10s， 55℃15s和72℃15s； 最后， 72℃10min延伸； 分别扩增B2 2R和RPO 30基因； CRISPR/Cas12a体系： 取B22R扩增反应液4μL分别加入到crRNA1和crRNA2的CRISPR/ Cas12a体系中； 取4 μL  RPO 30基因扩增液加入到crRNA3的CRISPR/Cas12a体系中； CRISPR/ Cas12a包含1 μM  LbCas12a  2 μL,1 μM crRNA 2 μL,1 μL 10 μM ssDNA‑LFA reporter,2 μL  10× NEB buffer 2.1和9 μL  ddH2O； 所述crRNA 为crRNA1序列、 crRNA2序列或crRNA3序列， 分别构 建包含crRNA1、 crRNA 2、 crRNA3的CRIS PR/Cas12a体系。 9.根据权利要求8所述基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属分型检测试纸条 试剂盒， 其特征在于： CRISPR/Cas12a系统反应完之后， 将试纸条插入ddH2O中， 室温下放置 2min， 结果判定如下： 同时出现T线和C线或者仅有T线为阳性， 只有C线则为阴性， 其中， crRNA1、 crRNA2和crRNA 3体系均有T线 为LSDV； 仅有crRNA2有T线 为SPPV； crRNA2和crRNA 3有 T线而crRNA1没有 T线为GTPV。 10.权利要求1‑9任一项所述基于阵列模式和CRISPR/Cas12a的羊痘病毒属分型检测试 纸条试剂盒在制备