(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210722144.2 (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 上海交通大 学 地址 200240 上海市徐汇区华 山路1954 号 申请人 上海纳米技 术及应用国家工程研究 中心有限公司 (72)发明人 崔大祥　倪健　刘彬　周诚　刘关　 田静　陈晓敏　崔明青　 (74)专利代理 机构 上海东亚专利商标代理有限 公司 31208 专利代理师 董梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于编码微球的肿瘤靶点定量PCR检测试剂 盒 (57)摘要 本发明基于编码微球的肿瘤靶点定量PCR检 测试剂盒,属于纳米生物技术领域， 涉及利用量 子点编码微球的标记技术， 具体为针对5个肿瘤 相关靶点PD ‑L1,VEGFR,EGFR,Her2， PIK3CA的新 型定量RT ‑PCR检测试剂盒。 本发明还包括该检测 试剂盒的使用方法和应用。 本发 明提供的编码微 球的组合包含至少5个编码微球， 这5个编码微球 上分别偶联有与扩增PD ‑L1,VEGFR,EGFR,Her2， PIK3CA的反向引物 。 与现有的常规定量RT ‑PCR试 剂盒相比， 本发明的试剂盒不仅提高了检测效 率， 而且检测更加简便 。 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 114921556 A 2022.08.19 CN 114921556 A 1.一种编码微球的组合， 其特征在于， 所述的编码微球的组合包含至少5个编码微球， 这5个编码微球上分别偶联有扩增P D‑L1, VEGFR, EGFR, Her2， PIK3CA的反向引物。 2.根据权利要求1所述的编码微球的组合， 其特征在于， 与扩增PD ‑L1, VEGFR, EGFR,  Her2， PIK3CA的反向引物偶联的5个编码微球的粒径各不相同； 或者 与扩增PD ‑L1, VEGFR, EGFR, Her2， PIK3CA的反向引物偶联 的5个编码微球是巯基化 修饰的CdSe@CdS与CdTe混合物的编码微球。 3.根据权利要求1或2所述的编码微球的组合的制备方法， 其特征在于， 所述的编码微 球的组合包含至少5个编码微球， 这5个编码微球分别与扩增PD ‑L1, VEGFR, EGFR, Her2， PIK3CA的反向引物偶联。 4.根据权利要求3所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述的制备 方法包括以下步骤： 通过高温热分解法制备CdSe@CdS异质结构四足量子点， 控制其吸收谱在蓝 ‑紫光区域， 发射谱在红光 ‑近红外区域可调； 采用化学合成方法制备5个不同粒径的CdTe量子点； 利用SPG膜乳化途径制备CdSe@CdS量子点与不同粒径的CdTe混合， 制备成5种不同粒径 的量子点编码微球； 利用巯基乙酸对制备的量子点编码微球进行修饰， 获得5种不同粒径巯基修饰的量子 点编码微球； 把5种不同粒径巯基修饰的量子点编码微球， 分别与PD ‑L1, VEGFR, EGFR, Her2， PIK3CA的反向引物偶联。 5.根据权利要求1或者2所述的编码微球的组合的应用， 其特征在于， 使用所述的编码 微球的组合扩增待测样品核酸， 确定待测样品核酸中PD ‑L1, VEGFR, EGFR, Her2， PIK3CA 的存在、 含量或者是否突变。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1,获取待测样本， 提取RNA进行反转录获得cDNA； S2,配制PCR反应混合液， 包括PCR缓冲液,  DNA聚合酶， 5种编码微球偶联的引物， 5种上 游引物， dNTP混合液， cDNA产物， 混匀； S3,进行PCR， 获得PCR产物以及PCR仪 显示的变性曲线与正常对照曲线； S4,比对PCR仪 显示的变性曲线与正常对照曲线， 判定靶基因是否存在突变； S5,根据PCR仪显示的变性曲线、 正常对照曲线或者PCR循环数， 或者通过定量PCR产物 的方法确定靶基因在待测样本中是否存在以及含量； 其中S4和S5择一或者同时使用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特 征在于， RT‑PCR的反应条件是： 37℃反转录反应15分钟， 然后， 95℃反应  30s； 或者 继续的PCR的反应条件是： ①95℃反应5s, ②60℃反应15s,   ③72℃反应30s， 步骤 ①‑③ 循环28‑42次； 或者 靶基因突变的判断标准是， 根据PCR仪显示的变性曲线与正常对照曲线， 判定是否存在 基因产物突变。 8.根据权利要求6所述的应用， 其特 征在于， PCR结果的判断标准是： 以内对照作为基准， 定量检测结果达 到20倍以上， 认定为靶基因在待测样品中 高表达；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921556 A 2定量检测结果达 到5‑10倍， 认定为靶基因在待测样品中等表达水平； 定量检测结果在5倍以内， 认定为低表达； 所述的靶基因是P D‑L1, VEGFR, EGFR, Her2或者PIK3 CA。 9.一种引物组合物， 其特 征在于， 所述的引物组合物含有下列引物中的一对或者多对： 第一对： 5 ’ ‑TTGTGTATGTC CCACCCCAGAT‑3’和5’ ‑AGTCCTCCACACTTCTCCATTCTT‑3’， 第二对： 5 ’ ‑  GAAAACACCGCAGCATGTCA ‑3’和5’ ‑CAAACAGTCAC CCCGTAGCTC ‑3’， 第三对： 5 ’ ‑GGGAAACCTGGAACTCACCTAC‑3’和5’ ‑ACTTGGTTGTGAGCGATGAGC ‑3’， 第四对： 5 ’ ‑GCCGAAGTCATCTG GACAAGC‑3’和5’ ‑GTGTTGATTCTCAGTGTGCTG GTCA‑3’， 第五对： 5 ′ ‑AGT GAT TTT AGA GAG‑3′和5′ ‑CTC TCT AAA ATC ACT‑3′。 10.一种检测试剂盒， 其特 征在于， 所述的试剂盒含有权利要求1的编码微球的组合。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921556 A 3