(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210698615.0 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 上海交通大 学 地址 200240 上海市徐汇区华 山路1954 号 申请人 上海纳米技 术及应用国家工程研究 中心有限公司 (72)发明人 崔大祥　张春雷　田静　刘关　 周诚　陈晓敏　 (74)专利代理 机构 上海东亚专利商标代理有限 公司 31208 专利代理师 董梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关GSTP1甲 基化PCR快速 检测方法及应用 (57)摘要 本发明属于纳米生物 技术领域， 涉及一种胃 癌相关GS TP1甲基化PCR快速检测方法。 本发明的 胃癌相关GS TP1甲基化PCR快速检测方法包括： 提 取样本中的基因组DNA， 基因组DNA经碱变性后采 用亚硫酸氢钠溶液处理， 将未甲基化的胞嘧啶转 化为尿嘧啶， 而甲基化的不变， 使用针对GS TP1甲 基化设计的引物扩增样本中的基因组DNA， 检测 PCR产物。 本发明设计制备了GS TP1甲基化检测的 PCR引物， 利用磁性纳米粒子的纳米酶催化活性， 提高了PCR反应效率和稳定性， 将PCR反应时间缩 短到20 min， 同时确 保100%特异性， 满足了胃癌 相关的GSTP1甲基化快速检测的需求。 本发明还 包括相应的引物、 试剂盒和应用。 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 115094124 A 2022.09.23 CN 115094124 A 1.一种GSTP1甲基化PCR快速检测方法， 其特征在于， 该胃癌相关GSTP1甲基化PCR快速 检测方法包括以下步骤： S1, 核酸提取： 提取样本中的基因 组DNA， S2, 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA： 上述基因组DNA经碱变性后采用亚硫酸氢钠溶液处 理， 将未甲基化的胞嘧啶转 化为尿嘧啶， 而甲基化的不变， S3, PCR扩增： 使用针对GSTP1甲基化设计的引物扩增样本中的基因组DNA， 所述 的PCR 扩增反应液中含有磁性纳米粒子， S4， 检测PCR产物。 2.根据权利要求1的GSTP1甲基化PCR快速检测方法， 其特征在于， 步骤S1中的核酸提取 是采用磁珠法提取样本中的基因 组DNA并定量； 或者 提取后核酸浓度为1  ng/mL～10 00 ng/mL， 优选的浓度为10 ‑100 ng/mL。 3.根据权利要求1的GSTP1甲基化PCR快速检测方法， 其特征在于， 步骤S2中的用于修饰 基因组DNA的亚硫酸氢钠浓度为0.2 ‑5 mol/L， 优选的浓度为1 ‑3 mol/L。 4.根据权利要求1的GSTP1甲基化PCR快速检测方法， 其特征在于， 步骤S3 的PCR扩增的 反应程序为： 95℃预变性30  s后再进行5‑50次循环， 每一次循环包括95℃变性5s和60℃退 火延伸5～120s； 优选的， 退火延伸时间10～6 0s， 循环次数为10 ‑40次。 5.根据权利要求1的GSTP1甲基化PCR快速检测方法， 其特征在于， 步骤S3中的引物包括 上游引物和下游引物， 均是长度为 10～50个碱基片段的寡核苷酸； 优选的引物长度为15 ‑35 个碱基片段的寡核苷酸序列。 6.根据权利要求1的GSTP1甲基化PCR快速检测方法， 其特征在于， 所述的胃癌相关 GSTP1甲基化PCR快速检测方法包括设计引物、 配置PCR反应液或者  PCR扩增产物鉴定的步 骤； 引物设计是针对GSTP1甲基化设计特异性引物； PCR高效反应液包括： 10 ×PCR buffer 10 μL, Taq DNA聚合酶， 上游引物1 μL， 下游引物 1 μL， DNA 样品2 μL， dNTP混合液15 μL， 磁性纳米粒子， 19 μL去离 子水； PCR扩增产物鉴定的步骤是指， 利用琼脂糖电泳凝胶对扩增产物进行分析； 优选地， 把 PCR产物加入电泳样品孔， 电压110V  电泳后， 紫外分析仪下观 察结果， 有目标PCR产物条带， 表明结果是 阳性， 无目标PCR产物条 带， 表明结果是 阴性。 7.根据权利要求6 的GSTP1甲基化PCR快速检测方法， 其特征在于， 所述的Taq  DNA聚合 酶酶活为0.5 ‑5U， 优选的Taq  DNA聚合酶 酶活为0.5 ‑1U； 或者 所 述的 特 异 性 引物 含 有以 下 序 列 ： T T C G G G G T G T A G C G G T C G T C 和 / 或 GCCCCAATACTAAATCACGACG； 或者 所述的琼脂糖凝胶的浓度 为0.5%～5%， 电泳时间为2～20  min， 优选的琼脂糖凝胶的浓 度为1%～3%， 电泳时间为5～10  min。 8.根据权利 要求1的GSTP1甲基化PCR快速检测方法， 其特征在于， 所述的磁性纳米粒子 为四氧化三铁纳米颗粒； 优选的， 四氧化三铁纳米颗粒的浓度为0.001  mg/mL～10  mg/mL， 水动力粒径分布为1  nm～1000  nm； 更优选的， 四氧化三铁纳米颗粒为球形， 浓度为0.1  mg/ mL～1 mg/mL， 水动力粒径分布为1  nm～50 nm。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115094124 A 29.一种引物， 其特征在于， 所述的引物含有以下序列： TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC和/或 GCCCCAATACTAAATCACGACG。 10.一种试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中含有针对GSTP1甲基化的PCR引物或者磁 性纳米粒子； 优选的， 所述的GSTP1甲基化的PCR引物是权利 要求9所述的引物， 或者所述的磁性纳米 粒子为四氧化 三铁纳米颗粒。 11.权利要求1所述的GSTP1甲基化PCR快速检测方法的应用， 其特征在于， 所述的胃癌 相关GSTP1甲基化PCR快速检测方法在选择胃癌的靶向药物中的应用。 12.根据权利要求11所述的应用， 其特征在于， 用于胃癌相关GSTP1甲基化阳性推荐靶 向用药包括但不限于 ５－氮杂胞嘧啶核苷； 或者 所述的应用包括： 使用胃癌相关GSTP1甲基化阳性推荐靶向用药处理胃癌相关GSTP1甲 基化阳性的细胞， 以减少GSTP1甲基化的含量或者比例。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115094124 A 3