(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210719393.6 (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 山东第一医科 大学 （山东省医学 科 学院） 地址 250117 山东省济南市槐荫区青岛路 6699号 (72)发明人 赵燕　崔亚洲　韩金祥　杨海宁　 邹卉　 (74)专利代理 机构 广东科信启帆知识产权代理 事务所(普通 合伙) 44710 专利代理师 李波 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于数字PCR平台的MMACHC基因 高频突变的 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测MMACHC基因高频突 变的引物探针组合物及其应用， 使用不同的荧光 报告基团分别对野生型探针和突变型探针进行 标记， 并结合质控品的检测结果， 可以对MMACHC 基因高频突变位点c.609G>A、 c.482G>A、 c.80A> G、 c.567dupT、 c.217C>T的突变情况进行检测， 检 测成本低， 周期短， 操作简单， 准确度高， 具有较 好的特异性， 能够满足临床的应用。 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图3页 CN 114854849 A 2022.08.05 CN 114854849 A 1.一种检测MMACHC基因高频突变的五种引物探针组合物， 所述的五种引物探针组合物 包括第一引物探针组合物、 第二引物探针组合物、 第三引物探针组合物、 第四引物探针组合 物、 第五引物探针组合物； 所述第一引物探针组合物用于检测MMACHC基因的c.609G>A位点； 由核苷酸序列依次如 SEQ ID NO.1～SEQ  ID NO.4所示的第一正向引物、 第一反向引物、 第一野生型探针和第一 突变型探针组成； 所述第二引物探针组合物用于检测MMACHC基因的c.482G>A位点， 由核苷酸序列依次如 SEQ ID NO.5～SEQ  ID NO.8所示的第二正向引物、 第二反向引物、 第二野生型探针和第二 突变型探针组成； 所述第三引 物探针组合物用于检测MMACHC基因的c.80A>G位点， 由核苷酸序列依次如 SEQ ID NO.9～SEQ  ID NO.12所示的第三正向引物、 第三反向引物、 第三野生型探针和第三 突变型探针组成； 所述第四引物探针组合物用于检测MMACHC基因的c.567dupT位点， 由核苷酸序列依次 如SEQ ID NO.13～SEQ  ID NO.16所示的第四正向引物、 第四反向引物、 第四野生型探针和 第四突变型探针组成； 所述第五引物探针组合物用于检测MMACHC基因的c.217C>T位点； 由核苷酸序列依次如 SEQ ID NO.17～SEQ  ID NO.20所示的第五正向引物、 第五反向引物、 第五野生型探针和第 五突变型探针组成。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述第一引物探针组合物、 第二 引物探针组合物、 第三引物探针组合物、 第四引物探针组合物和第 五引物探针组合物中的 每条引物的Tm值独立 地为58～60℃； 优选地， 所述引物之间的Tm值差异在2℃内。 3.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述探针为Taqman探针， 所述 Taqman探针的5 ’端标记有荧光报告基团， 3 ’端标记有淬灭基团； 优选地， 所述荧光报告基团 包括FAM和/或VIC； 所述淬灭基团包括MGB。 4.根据权利要求3所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述野生型探针的荧光报告基团 与所述突变型探针的荧 光报告基团不同。 5.一种MMACHC基因高频突变的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒权利 要求1‑4 任一项所述的引物探针组合物。 6.根据权利要求5所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括PCR反应液； 优选 地， 所述PCR反应液包括DNA聚合酶、 Mg2+缓冲液、 dNTPs和水。 7.根据权利要求6所述的检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂盒还 包括质控品。 8.根据权利要求7 所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述质控品包括无酶水。 9.权利要求1 ‑4所述的引物探针组合物或权利要求5 ‑8所述的检测试剂盒的使用方法， 其特征在于， 所述方法包括如下步骤： 1)提取待测样本的DNA； 2)数字PCR扩增， 同时进行阴 性质控品的检测； 3)扩增完毕的芯片放入生物芯片阅读仪， 检测荧 光信号并进行分析。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述分析为比较所述待测样本的荧光信 号及散点图确定所述待测样 本的基因型， 通过FAM和V IC的荧光信号及散点图确定所述待测 样本的突变情况。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854849 A 2基于数字PCR平台的M MACHC基因高频突变的检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种用于检测MMACHC基因高频突变位点的试 剂盒。 背景技术 [0002]甲基丙二酸血症(Methylmalonic  Acidemia,MMA)， 也称甲基丙二酸尿症， 是常见 的有机酸代谢病， 由于体内缬氨酸、 异亮氨酸、 蛋氨酸、 苏氨酸和奇数碳脂肪酸分解代谢过 程中的甲基丙二酰辅酶A不能转化为琥珀酰辅酶A， 旁路代谢增强， 甲基丙二酸和甲基枸橼 酸等毒性物质异常蓄积， 造成多脏器损伤， 尤其是神经系统损伤， 严重时常危及生命。 该病 属常染色体隐性遗传， 在全球的发病率约为1:48,000～1:250000， 在中国的发病率为1/ 28004,而在山东省的发病率高达1/3920。 MMA分为单纯型甲基丙二酸血症和甲基丙二酸血 症合并同型半胱氨 酸血症两种类型。 该病临床表现个体差异大， 可表现为多系统受累， 自胎 儿时期至成年时期均可发病， 容易漏诊、 误诊， 基因检测是临床分型 的可靠依据， 早期分子 检测和预防尤为关键。 目前临床关于MMA检测方法主要 是生化检查串联质谱检测， 而基因突 变检测方法是价格较贵高通量测序， 且因为测序仪器环境要求严格都是外送检测， 基因突 变的高通 量测序检测在临床推广具有一定困难。 [0003]在中国MMA患者中合并型MMA最常见， 合并型MMA包括cb1C、 cb1D及cb1F三种亚型， 其中以cb1C 型为主， 其编码基因是MMA CHC， 其中c.609G>A、 c.80A>G、 c.56 7dupT、 c.482G>A和 c.217C>T  5个突变位点在临床检出率高， 在MMACHC基因中共覆盖大于60％的突变。 虽然引 起MMA发病的突变位点较多， 全球范围内的突变类型具有地区差异 性， 国外最常见的类型是 MUT基因突变， 而我国最常见的为cblC型。 但是我国目前没有专门用于该基因热点突变区域 基因突变的检测试剂盒。 因此， 如何建立一种简便、 快速、 经济和准确的合并型甲基丙二酸 血症基因高频突变筛查方法， 为MMA的预防、 辅助临床诊断和预后评估提供技术支持， 已成 为亟待解决的问题。 发明内容 [0004]针对临床上MMA关于基因检测方法的实际需求， 本发明提供一种检测MMACHC基因 高频突变的引物探针组合物及其应用， 使用不同的荧光报告基团分别对野生型探针和突变 型探针进行标记， 并结合质控品的检测结果， 可以对MMACHC基因高频突变位点c.609G>A、 c.482G>A、 c.80A>G、 c.567 dupT、 c.217C>T的突变情况进行检测， 检测成本低， 周期短， 操作 简单， 准确度高， 具有较好的特异性， 能够满足临床的应用。 [0005]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0006]第一方面， 本发明提供了一种基于数字PCR平台检测MMACHC基因高频突变的五种 引物探针组合物， 所述的五种引物探针组合物包括第一引物探针组合物、 第二引物探针组 合物、 第三引物探针组合物、 第四引物探针组合物、 第五引物探针组合物； [0007]在某些实施方式中， 所述第一引物探针组合物用于检测MMACHC基因的c.609G>A位说　明　书 1/8 页 3 CN 114854849 A 3