(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210595235.4 (22)申请日 2022.05.28 (71)申请人 四川大学华西第二医院 地址 610000 四川省成 都市人民南路3段20 号 (72)发明人 易棵　 (74)专利代理 机构 成都中络智合知识产权代理 有限公司 513 00 专利代理师 喻依丰 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于数字PCR一步法检测血液中登革热、 寨 卡病毒的方法 (57)摘要 本申请公开了基于数字PCR一步法检测血液 中登革热、 寨卡病毒的方法， 具体由以下步骤组 成： 取90ul待检测的血液样本Y0， 10ul的PCR反应 液A混合， 自然反应10min后获得血液样本Y1； 取 25ul上述步骤中获得的血液样本Y1并向血液样 本Y1中分别按照15:6:4的比例加入PCR反应液B、 PCR反应液C、 PCR反应液D， 同时加入乳化剂振荡 摇匀获得血液样本Y2； 将血液样本Y2加入微滴式 数字PCR仪生成微滴进行PCR扩增并输出检测结 果。 本发明克服了数字PCR需要先提取样本核酸 过程， 传统数字PCR需要先进行样本核酸提取， 再 接着进行反转录， 反转录后构建数字PCR反应体 系操作繁琐问题， 本发明直接利用PCR反应体系 与待测样本混合即可利用现有的数字PCR仪进行 一步检测， 高效， 准确。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114891927 A 2022.08.12 CN 114891927 A 1.基于数字PCR一步法检测血液中登革热、 寨卡病毒的方法， 其特征在于， 具体由以下 步骤组成： 步骤STP100， 取90ul待检测的血液样本Y0， 10ul的PCR反应 液A混合， 自然反应10min后获 得血液样本Y1； 其中， PCR反应液A由10m g/mL莎梵婷， 2％的SDS(m/V)， 0.1％的NP ‑40(V/V)和 150mmol/L的MgCl2组成； 步骤STP200， 取25ul步骤STP100中获得的血液样本Y1并向血液样本Y1中分别按照15:6: 4的比例加 入PCR反应液B、 PCR反应液C、 PCR反应液D， 同时加入乳化剂振荡摇匀获得血液样 本Y2； 其中， PCR反应液B由5mmol/L  Mg Cl2， pH＝8.3， 33mmol/L的Tris ‑HCL， 0.66mmol/L的 dGTP,0.6 6mmol/L的dATP  0.66mmol/L的dCTP， 0.4m mol/L的dTTP和0.66mmol/L的dUTP组成； PCR反应液C由80U/ul反转录酶、 8U/ul的Taq  DNA聚合酶、 0.08的MDTT、 pH＝7.4， 4mmol/ L的Tris‑HCL； 40mmol/L的NaCl； 16U/mL的RNase  Inhibitor组成； PCR反应液D由登革热引物对： 引物 ‑F： SEQ ID NO： 1， 引物 ‑R： SEQ ID NO： 2和探针： SEQ   ID NO： 5； 以及寨卡病毒引物对： 引物 ‑F： SEQ ID NO： 3， 引物 ‑R： SEQ ID NO： 4和探针： SEQ  ID  NO： 6组成； 乳化剂为体积比为6:4 的硅油和16烷烃混合物， 再加入4％的EM90+2％的TritonX ‑100 和2％的吐温 ‑20混合摇匀获得； 步骤STP300， 将血液样本Y2加入微滴式数字PCR仪生成微滴进行PCR扩增并输出检测结 果； 其中， PCR扩增程序如下： ①逆转录， 温度为37℃， 时间保持3 0min， 反应循环数为1次； ②预变性， 温度为95℃， 时间保持10mi n， 反应循环数为1次； ③变性， 温度为95℃， 时间保持3 0s， 反应循环数为 40次； ④退火， 温度为5 5℃， 时间保持15s， 反应 循环数为 40次； ⑤延伸， 温度为72℃， 时间保持40s， 反应 循环数为 40次； ⑥灭活， 温度为98℃， 时间保持10mi n， 反应循环数为1次； ⑦Hold， 温度为 4℃， 时间保持 +∞min， 反应循环数为1次。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891927 A 2基于数字PCR一步法检测血液中登革热、 寨卡病毒 的方法 技术领域 [0001]本发明涉及 生物试剂领域， 尤其涉及利用生物试剂定性定量检测现有病毒的方法 技术领域， 具体涉及基于数字PCR一 步法检测血 液中登革热、 寨卡病毒的方法。 背景技术 [0002]登革病毒(Dengu e virus， DENV)和寨卡病毒(Zika  virus， ZIKV均是蚊虫媒介传播 的黄病毒 科、 黄病毒属病毒， 均属于单正链RNA病毒， 全长约11kb。 登革热病毒包括四个血清 型， 常引起登革热， 甚至发展为登革出血热及登革休克综合征， 广泛分布于热带和亚热带地 区， 发热、 头痛、 全身肌肉及关节痛 等为其主要临床特征。 寨卡病毒病是寨卡病毒引起的， 临 床表现为轻微 发热、 红疹(多 数为斑丘疹)、 头痛、 关节痛以及结膜炎等， 也会引起小头畸形、 格林巴利综合症以及其他胎儿中枢神经系统畸形。 WHO曾将寨卡病毒感染及其相关新生儿 小头畸形等神经系统疾病列为 “国际关注的突发 公共卫生事件”。 [0003]数字PCR(Digital  PCR， dPCR)技术是一种全新的核酸定量方法， 通过将普通PCR的 指数信号转化为数字信号， 从而对样本中的病毒达到绝对定量效果。 数字P CR主要是将总的 模板PCR反应体系进行分液， 分配为许多单独的PCR反应， 使其在许多反应室中进行PCR扩 增； PCR扩增完后， 通过检测 每个反应的荧光信号的有或无来计算模板的拷贝数， 最后通过 泊松分布的统计学处理， 得到样品中病毒DNA或RNA的浓度。 相比较于实时荧光定量PCR技 术， 数字P CR不需要建立标准曲线， 并对低浓度的临床样 本定量检测。 现有的数字PCR 需要先 提取样本核酸过程， 传统数字PCR一般是先进行样本核酸提取， 再接着进行反转录， 反转录 后构建数字PCR反应 体系。 发明内容 [0004]为了解决现有数字PCR技术存在需要进行核算提取、 转录的问题， 本申请提供基于 数字PCR一步法检测血液中登革热、 寨卡病毒的方法， 能够广泛的捕捉寨卡病毒和登革热病 毒并进行定量检测。 [0005]为了达到上述目的， 本申请所采用的技 术方案为： [0006]基于数字PCR一 步法检测血 液中登革热、 寨卡病毒的方法， 具体由以下步骤组成： [0007]步骤STP100， 取90ul待检测的血液样本Y0， 10ul的PCR反应液A混合， 自然反应 10min后获得血液样本Y1； 其中， PCR反应液A由10mg/mL莎梵婷， 2％的SDS(m/V)， 0.1％的NP ‑ 40(V/V)和15 0mmol/L的MgCl2组成； [0008]步骤STP200， 取25ul步骤STP100中获得的血液样本Y1并向血液样本Y1中分别按照 15:6:4的比例加入PCR反应液B、 PCR反应液C、 PCR反应液D， 同时加入乳化剂振荡摇匀获得血 液样本Y2； [0009]其中， PCR反应液B由5mmol/L  Mg Cl2， pH＝8.3， 33mmol/L的Tr is‑HCL， 0.66mmol/L 的dGTP,0.66mmol/L的dATP  0.66mmol/L的dCTP， 0.4mmol/L的dTTP和0.66mmol/L的dUTP组 成；说　明　书 1/5 页 3 CN 114891927 A 3