(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210779291.3 (22)申请日 2022.07.04 (71)申请人 江苏康极生物医药 科技有限公司 地址 224000 江苏省盐城市 盐城经济技 术 开发区希望大道南路5号 4幢1301室-2 (72)发明人 赵保兵　张晶鑫　高丹丹　王智凤　 (74)专利代理 机构 河南银隆律师事务所 41 186 专利代理师 周游 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测 方法及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种基于多重聚合酶链式反 应的EGFR突变检测方法及试剂盒， 其中检测方法 包括通过多重PCR对EGF R基因进行N GS文库构建、 测序文库的纯化、 测序和结果分析步骤， 试剂盒 内包括特异性引物对 （引物混合液） 、 EGFR特异性 扩增引物、 10 ×Buffer、 dNTP、 Taq酶、 多重PCR混 合液、 TE Buffer、 纯化磁珠。 本发明所述的检测 方法和试剂盒操作 简单， 只需1次扩增及1次纯化 过程， 本发明基于多重PCR与二代测序技术的联 合， 可以对低浓度样本进行特异性识别， 检测灵 敏度高且检测特异性高。 权利要求书2页 说明书7页 附图3页 CN 115449541 A 2022.12.09 CN 115449541 A 1.基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 通过多 重PCR对EGFR基因进行NGS文库构建、 测序文库的纯化、 测序和结果分析； 其中， EGFR突变位 点包括EGFR基因A289V位点、 R521K位点、 G598V位点、 G719X位点、 S768I位点、 T790M位点、 L858R位点、 L861Q 位点、 19Del 位点及20Ins位点。 2.如权利要求1所述的基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法， 其特征在于： 通 过多重PCR对EGFR基因进行NGS文库构建的构建方法包括， 1） 、 提取： 提取基因组样本中基因组， 并对对提取后的产物使用2%琼脂糖凝胶进行电 泳， 观察条 带大小和纯度情况； 2） 、 预处理： 通过Qubit  4荧光计测定基因组提取后的浓度， 保持其制备浓度为10  ng/ μ L， 检测成功得到多重PCR模板； 3） 、 制样： 将为多重PCR模板与2 ×Taq 酶、 引物混合液混合， 并由ddH2O将混合物补足至 40 μL； 4） 、 PCR扩增： 将混合物放置于PCR仪上扩增， 并在98℃下进行预变性5min、 95℃下变性 30sec、 60℃下退火30sec、 72℃下延伸3 0sec、 72℃下终延伸2mi n， 并在4℃下保温； 5） 后处理： 将反应后PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳， 观察条带大小和纯度情况， 同时通过Qubit  4荧光计测定构建的文库片段的浓度。 3.如权利要求2所述的基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法其特征在于： 基 因组样本来源于血浆、 血清、 血液、 尿液、 汗液、 唾液、 精液、 胸水、 腹水、 粪便、 穿刺样本和石 蜡包埋组织切片样本中的至少一种。 4.如权利要求1所述的基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法其特征在于： 所 述测序文库的纯化包括如下步骤， a)向含有扩增产物的PCR管中加入30 μL提前平衡至室温的纯化磁珠， 混合均匀， 25℃孵 育5min； b)将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5min至液体完全澄清， 使用移液器吸取移弃上 清； c)沿离心管壁缓慢加入20 0 μL新鲜配制的80％乙醇， 静置 30sec， 使用移液器移弃 上清； d)重复以上步骤一次； e)离心管置 于磁力架上， 使用10 μL吸头移去少量残留乙醇； f)将磁珠置 于室温干燥2 ‑5min， 至乙醇挥发完全； g)移出PCR管， 向PCR管中加入21 μL  TE Solution， 将磁珠 悬浮混匀， 25℃孵 育5min； h)将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5min至液体完全澄清， 使用移液器小心吸取20 μ L上清转移至一个新的0.2mL  PCR管中保存； I)通过Qubit  4荧光计及2%琼脂糖凝胶对文库进行浓度、 纯度及片段长度的测量。 5.如权利要求4所述的基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法其特征在于： 所 述测序通过Illumina  二代测序仪进行测序分析； 所述结果分析是通过生物信息学进行比 较分析， 具体操作步骤如下： Ⅰ） 、 将测序结果与参 考基因序列比对， 并寻找SNP和I ndel； Ⅱ） 、 运用AN NOVAR软件对SNP、 Indel位点进行注释、 确定突变位 点对应的基因信息 。 6.如权利要求1 ‑5中任一所述的基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测试剂盒， 其权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115449541 A 2特征在于： 包括检测EGF R A289V位点、 EGF R R521K位点、 EGF R G598V位点、 EGF R L858R位点、 EGFR L861Q位点、 EGFR  G719X位点、 EGFR  S768I位点、 EGFR  T790M位点、 EGFR  19Del位点及 EGFR 20Ins位点之间突变的特异性引物对 （引物混合液） 、 EGFR特异性扩增引物、 10 × Buffer、 dNTP、 Taq酶、 多重PCR混合液、 TE  Buffer、 纯化磁珠。 7.如权利要求6所述基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测试剂盒， 其特征在于： 所 述多重PCR混合液组分包括多重PCR模板3  μL、 2×Taq 酶20 μL、 引物混合液4  μL、 ddH2O13 μ L。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115449541 A 3