(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210753423.5 (22)申请日 2022.06.29 (66)本国优先权数据 202110731382.5 2021.0 6.29 CN (71)申请人 中国人民解 放军空军 军医大学 地址 710032 陕西省西安市新城区长乐西 路169号 (72)发明人 李纪鹏　张瑞　姜勋亮　王珂　 刘俊　丁晓琛　 (74)专利代理 机构 西安通大专利代理有限责任 公司 6120 0 专利代理师 范巍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于外泌体miRNA-206表达 水平的胃癌恶液 质早期诊断试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种基于外泌体miRNA ‑206表 达水平的胃癌恶液质早期 诊断试剂盒， 该试剂盒 包括Hsa‑miR‑206的实时定量PCR扩增引物 。 采集 未确诊恶液质 的胃癌患者外周血， 离心得到血 浆， 提取血浆中的外泌体RNA， 将其中的miRNA反 转录成cDNA作为模板， 通过实时定量PCR检测血 浆外泌体中的Hsa ‑miR‑206的含量， 从而为预测 胃癌恶液质提供重要参 考。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图5页 CN 115287354 A 2022.11.04 CN 115287354 A 1.一种检测血浆中外泌体miRNA ‑206含量的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 1)提取胃癌患者血浆 中的外泌体RNA， 将所述外泌体RNA中的miRNA反转录， 得到外泌体 miRNA的反转录 本； 2)以所述外泌体miRNA的反转录本为模板， 通过实时定量PCR扩增血浆外泌体中的Hsa ‑ miR‑206， 并确定血浆外泌体中的Hsa ‑miR‑206的扩增循环阈值； 3)计算所述Hsa ‑miR‑206的扩增循环阈值与内参基因的扩增循环阈值的差值Δ CT。 2.根据权利要求1所述一种检测血浆中外泌体miRNA ‑206含量的方法， 其特征在于： 所 述步骤2)中， 血浆外泌体中的Hsa ‑miR‑206的实时定量PCR扩增引物由上游引物和下游引物 组成， 其中， 下游引物为miRNA通用引物， 上游引物的序列为： 5`‑TGGAATGTAAGGAAGTGTGTG G‑3`。 3.一种胃癌恶液质早期诊断试剂盒， 其特征在于： 该试剂盒包括Hsa ‑miR‑206的实时定 量PCR扩增引物。 4.根据权利要求3所述一种胃癌恶液质早期诊断试剂盒， 其特征在于： 所述Hsa ‑miR‑ 206提取自胃癌患者外周血。 5.根据权利要求3所述一种胃癌恶液质早期诊断试剂盒， 其特征在于： 所述Hsa ‑miR‑ 206提取自胃癌患者的血浆外泌体。 6.根据权利要求5所述一种胃癌恶液质早期诊断试剂 盒， 其特征在于： 所述血浆外泌体 中的Hsa‑miR‑206的实时定量PCR扩增引物由上游引物和下游引物组成， 其中， 下游引物为 miRNA通用引物， 上游引物的序列为： 5`‑TGGAATGTAAGGAAGTGTGTG G‑3`。 7.根据权利要求5所述一种胃癌恶液质早期诊断试剂 盒， 其特征在于： 当 胃癌患者血浆 外泌体中的H sa‑miR‑206的扩增循环阈值与内参基因的扩增循环阈值的差值ΔCT超 出限值 时， 该差值Δ CT越接近限值则表明该患者患恶液质的风险越高。 8.Hsa‑miR‑206在制备胃癌恶液质早期诊断试剂盒中的应用。 9.Hsa‑miR‑206的反转录 本在制备胃癌恶液质早期诊断试剂盒中的应用。 10.Hsa‑miR‑206的扩增引物在制备胃癌恶液质早期诊断试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115287354 A 2基于外泌体miRNA ‑206表达水 平的胃癌恶液质早期诊断试 剂盒 技术领域 [0001]本发明属于肿瘤医学领域， 涉及检测血浆外泌体中Hs a‑miR‑206的含量， 以及用于 根据外泌体miRNA ‑206表达情况对胃癌恶液质进行早期诊断的试剂盒。 背景技术 [0002]胃癌(Gastric  cancer， GC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一， 具有高发病率、 高死 亡率的特点， 发病率和死亡率逐年上升。 尽管随着医疗技术的不断发展， 癌症的治疗手段正 在不断被人们所研究， 但是由于胃癌发病率高， 且 具有早期不易诊断的特点， 提高胃癌患者 的生存率依然面临巨大挑战。 恶液质是一种多因素代谢综合症， 恶液质患者临床主要表现 为体重减轻和肌肉萎缩(伴随或不伴随脂肪丢失)， 肿瘤引起的恶液质最为常见， 称肿瘤恶 液质(Cancer  cachexia)。 研究表明， 超过20％的肿瘤恶液质患者直接死于恶液质， 恶液质 在胃肠道肿瘤中尤为常见， 80％的胃癌患者都会出现恶液质。 肿瘤患者发生恶液质后对化 疗药毒性更敏感， 生活质量也降低， 因此严重影响肿瘤患者的预后。 目前尚缺乏诊断和治疗 恶液质的有效手段， 许多研究都集中在预测肿瘤恶液质发生的生物标记物方面。 但一般血 清标志物的检测 对恶液质的预测价值不高， 例如CEA、 CA19 ‑9、 CA724等肿瘤标志物， 仅能预 测发生肿瘤的可能性， 而不能预测恶液质的发生。 [0003]外泌体的功能之一是作为细胞 间通讯的介质， 与肿瘤的增殖、 凋亡、 耐药和转移息 息相关。 而作为主要的活性物质之一的非编码RNA， 是外泌体发挥以上功能的生物学基础。 非编码RNA主要包括微小RNA(microRNA， miRNA)、 长链非编码RNA(long  non‑coding RNA， lncRNA)， 以及 环状RNA(ciRNA)等。 其中， miRNA是一类长度为19～25nt的内源单链RNA， 其通 过转录后基因沉默机制 对下游靶mRNA发挥精细调节作用， 影响细胞的恶性转化、 非锚定依 赖性生长、 上皮间质转化、 血管生成、 药物耐受等诸多肿瘤 恶性表型。 外泌体能够携带miRNA 进入循环系统， 通过自分泌、 旁分泌和内旁分泌的方式将其囊泡结构中所含miRNA(即外泌 体miRNA)运送至特异的靶细胞， 使外泌体中的mi RNA不仅能够逃避降解， 而且促进了细胞与 细胞之间、 组织与组织之间的联系。 [0004]随着miRNA的发现， 众多 miRNA被证 实参与炎症反应、 诱导转移以及介导癌 症侵袭， 甚至参与骨骼肌中蛋白质的合成和降解通路。 肿瘤的发生能触发肿瘤细胞与肌肉细胞的交 流， 引起肌肉中蛋白质的降解和代谢。 肿瘤发展 过程中mi RNA表达谱的变化能影响肌肉相关 的疾病的发生。 改变miRNA的含量能够影响肌生成， 导致骨骼肌肥大或萎缩， 进而导致恶液 质的发生， 其机制可能是通过诱导肌细胞内凋亡相关信号通路或泛素蛋白酶系统激活， 从 而促进肌细肉中 蛋白质降解。 [0005]Hsa‑miR‑206是一种脊椎动物所特有的mi RNA， 因而它具有动物miRNA的共性。 H sa‑ miR‑206首先由RNA聚合酶 Ⅱ转录生成原始miRNA转录产物(pri ‑miRNA‑206)， 其在细胞核内 经一种称为Drosha的RNA内切酶 Ⅲ加工， 得到茎 ‑环结构的miRNA ‑206前体(pre ‑miRNA‑ 206)。 随后， pre ‑miRNA‑206被Exportin ‑5蛋白运输到细胞质中， 再经第二种 RNA内切酶 Ⅲ说　明　书 1/7 页 3 CN 115287354 A 3