(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210707494.1 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 山东省滨州畜牧兽医研究院 地址 256600 山东省滨州市黄河二路169号 (72)发明人 苗立中　于新友　王艳　王玉茂　 沈志强　 (74)专利代理 机构 青岛鼎尖知识产权代理有限 公司 37318 专利代理师 李慧 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于双重荧光RT-PCR鉴别检测试剂盒、 方法 及应用 (57)摘要 本发明公开了基于双重荧光RT ‑PCR鉴别检 测试剂盒、 方法及应用， 具体涉及分子生物学检 测技术领域， 包括RHDV和RHDV2引物 探针组， 所述 RHDV和RHDV2引物 探针组包 括针对经典RHDV的特 异性引物对、 TaqMan探针和针对RHDV2的特异性 引物对、 TaqMan探针； 所述针对经典RHDV的特异 性引物对包括正向引物序列如SEQ  ID NO.1所示 和反向引 物序列SEQ  IDNO.2所示。 本发明通过4 条引物及2条探针加入同一荧光RT ‑PCR反应体系 中， 彼此之间不干扰检测 效果， 一次加样进行扩 增， 实时观察扩增结果， 有效克服了现有试剂盒 操作繁琐， 时间长， 特异性差的缺陷， 能用于临床 经典RHDV和RHDV2疑似样本的快速鉴别检测。 适 用于科研单位和基层单位RHD的流行病学调查和 疾病检测， 具有良好的商 业应用前景， 对我国RHD 的防控具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图1页 CN 114959119 A 2022.08.30 CN 114959119 A 1.基于双重荧光RT ‑PCR鉴别检测试剂盒， 包括RHDV和RHDV2引 物探针组， 其特征在于： 所述RHDV和RHDV2引物探针组包括针对经典RHDV的特异性引物对、 TaqMan探针和针对RHDV2 的特异性引物对、 TaqMan探针； 所述针对经典RHDV的特异性引物对包括正向引物序列如SEQ  ID NO.1所示和反向引物 序列SEQ ID NO.2所示； 所述针对RHDV2的特异性引 物对包括正向引物序列如SEQ  ID NO.3所示和 反向引物序 列SEQ ID NO.4所示； 所述经典RHDV的探针序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述RHDV2的探针序列如SEQ  ID NO.6 所示。 2.根据权利 要求1所述的基于双重荧光RT ‑PCR鉴别检测试剂盒， 其特征在于： 所述针对 经典RHDV的特异性引物、 TaqMan探针和针对RHDV2的特异性引物、 TaqMan探针均是根据各自 VP60基因碱基序列特点所设。 3.根据权利 要求1所述的基于双重荧光RT ‑PCR鉴别检测试剂盒， 其特征在于： 所述经典 RHDV探针5 ’端标记FAM荧光基团， 3 ’端标记BHQ1淬灭基团， 所述RHDV2探针5 ’端标记HEX荧光 基团， 3’端标记BHQ1淬灭基团。 4.一种如权利 要求1‑3任意一项所述的基于双重荧光RT ‑PCR鉴别检测试剂盒中的引物 探针在鉴别检测经典 RHDV和RHDV 2荧光RT‑PCR检测试剂盒中的应用。 5.一种如权利 要求1‑3任意一项所述的基于双重荧光RT ‑PCR鉴别检测试剂盒的检测方 法， 其特征在于： 所述检测方法的总反应体系为2 0 μL： 其中2 ×One Step RT‑PCR Buffer 10 μL， DNA聚合酶Ex  Taq HS 0.5 μL， 反转录酶PrimeScrip tRT Enzyme Mix0.5 μL， SEQ  ID NO.1 (15 μmol/L)1.2 μL， SEQ  ID NO.2(15 μmol/L)0.8 μL， SEQ  ID NO.3(15 μmol/L)1.5 μL， SEQ  ID  NO.4(15 μmol/L)1.2 μL， SEQ  ID NO.5(10 μmol/L)0.5 μL， SEQ  ID NO.6(10 μmol/L)0.8 μL， 模 板3 μL。 6.根据权利要求5所述的基于双重荧光RT ‑PCR鉴别检测试剂盒的检测方法， 其特征在 于： 所述检测方法的反应程序为： 42℃ 反转录5min； 95℃预变性30s； 95℃变性5s， 55℃退火 20s， 共计40个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959119 A 2基于双重荧光RT ‑PCR鉴别检测试剂盒、 方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学检测技术领域， 具体涉及 基于双重荧光RT ‑PCR鉴别检测试 剂盒、 方法及应用。 背景技术 [0002]兔出血症病毒(Rabbit  hemorrhagic  disease virus， RHDV)是杯状病毒科、 兔病 毒属， 病毒 粒子呈球形， 无囊膜， 基因组为单股正链RNA。 兔出血症病毒感染兔后引起兔出血 症(Rabbit  hemorrhagic  disease， RHD)， RHD是兔的一种烈性传染病， 临床 发病率高， 表现 为兔全身 各内脏器官广泛出血、 淤血， 发病急、 传播迅速， 兔大量死亡， 给养殖户造成严重的 经济损失。 [0003]RHDV基因组RNA的特点决定了其容易发生变异、 重组， 加上长期商品化疫苗防控兔 出血症的策略， 更加促进了兔出血症病毒基因组变异。 2010年， 法国首次报道了由兔出血症 病毒2型(Rabbit  hemorrhagic  disease virus 2， RHDV2)引起的兔出血症， 随后多个国家 均有报道， 且逐渐替代经典RHDV成为主流毒株。 我国2020年4月首次报道RHDV2引起的RHD， 不同于经典RHDV仅对成年家兔致病， RHDV2还能感染幼兔和野兔致大量死亡， 给兔场造成毁 灭性打击， 部分场兔可全部死 亡， 场面非常凄惨。 [0004]经典RHDV和RHDV2引发的兔出血症表现类似， 病变几乎相同， 仅凭临床和经验很难 辨别， 即使是最有经验的兽医也很难对这种两种病原引起的RHD做出鉴别。 经典RHDV和 RHDV2交叉保护性差， 当前所用商品化疫苗均为针对经典RHDV研发， 对RHDV2免疫保护性效 果差， 仅50％左右。 至于其他病原学检测试剂盒， 如病原分离、 血清学检测、 常规RT ‑PCR等应 用均受到限制， RHDV分离培养方法目前尚未成熟， 血清学检测不能判定现症感染， 常规RT ‑ PCR操作繁琐， 检测敏感性低， 可能导致漏检， 且易造成实验室气溶胶污染。 荧光RT ‑PCR检测 病原方法已经成熟， 操作简单、 敏感性高、 特异性好， 重复性好， 针对病原核酸检测， 是成熟 的方法。 [0005]多重荧光PCR检测病原的方法尚未成熟， 检测方法建立及检测试剂盒研制具有一 定的难度， 主要是多种引物和探针处于同于体系中时容易互相干扰， 因此， 引物和探针设计 非常关键。 因经典RHDV和RHDV2基因组中VP60基因同源性在81％， 使得鉴别检测两种病原的 引物和探针的设计更加复杂， 各种引物和探针之间的比例、 退火温度大小等都会影响扩增 结果， 不同探针标记 不同的荧光基团， 因此， 荧光P CR检测方法的建立需要优化各种条件。 选 择不同厂家试剂进 行比对分析， 选择性价比高， 检测效果好的试剂， 一款优质检测试剂盒的 研制并非想的那么简单， 需要大量的时间和精力付出， 不断调试验证。 [0006]当前所用商品化RHD疫苗可用于兔场发病后紧急免疫接种， 3 天后起效， 1周内基本 可控制发病， 当然前提是兔场所发生RHD为经典RHDV引起， 如果是RHDV2所引起效果可能不 理想。 鉴于RHDV2自身特性以及在发生 国家已经成为主流毒株的情况， 不排除RHDV2在我国 大面积爆发和流行和风险， 因此， 有必要采用敏感、 特异的检测试剂盒开展RHD流行病学检 测和检测， 以便及时确诊病原， 采 取相应防控措施， 将RHD控制消灭于疾病的初 级阶段， 也可说　明　书 1/9 页 3 CN 114959119 A 3