(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210691128.1 (22)申请日 2022.06.18 (71)申请人 福州大学 地址 350108 福建省福州市闽侯县福州大 学城乌龙江北 大道2号福州大 学 (72)发明人 黄小翠　林振宇　邱彬　罗芳　 李维鑫　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 专利代理师 林文弘　蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6825(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) G01N 21/76(2006.01)G01N 27/327(2006.01) G01N 27/416(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于串联催化发夹组装技术的双靶标核酸 序列响应的电化学传感器的构建及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种基于串联催化发夹组装技 术的双靶标核酸序列响应的电化学传感器的构 建及其应用， 首先合成碳量子点， 通过酰胺键将 碳量子点与修饰有氨基的NH2探针结合； 通过金 硫键将捕获探针组装于Au电极表面， 用MCH封闭 电极表面未结合位点； 通过与 捕获探针杂交的方 式将OH2探针结合到Au电极表面； 将待测样品与 OH1探针、 NH1探针及碳量子点标记的NH2探针混 合， 将Au电极浸入其中， 孵育后冲洗Au电极并转 移到电化学发光工作溶液中， 通过施加一定的电 压， 使用微弱发光仪收集发光信号。 该电化学传 感器制备方法及检测方法操作简便， 可在40分钟 的响应时间内对目标核酸进行快速定量分析， 定 量范围宽 至50 pM至200 nM。 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 115058489 A 2022.09.16 CN 115058489 A 1.一种基于串联催化发夹组装技术的双靶标核酸序列响应的电化学传感器的构建方 法， 其特征在于： 包括以下步骤： S1： 使用一步水热法合成表面富含氨基和羧基的碳量子点， 通过酰胺键作用将碳量子 点与修饰有氨基的NH2探针结合， 得到碳 量子点标记的NH2探针， 即为CDs ‑NH2； S2： 将Au电极进行抛光、 清洗及活化处理， 通过金硫键作用使巯基修饰的CP探针结合到 Au电极上， 并用6 ‑巯基‑1‑己醇封闭电极表面未结合位点， 再将OH2探针通过与CP探针杂交 的方式结合到Au电极表面， 得到OH2探针占据CP探针自由结合端的Au电极； S3： 将待测样品与OH1探针、 NH1探针及步骤S1中获得的CDs ‑NH2混合， 将步骤S2得到的 Au电极上浸入其中， 孵育， 冲洗Au电极 并转移到电化学发光工作溶液中， 在电化学工作 站上 采集电化学发光信号， 进 而完成所述电化学传感器的构建； 其中， 所述的修饰有氨基的NH2探针的序列为： 5’ ‑GAGATCTTGTCAAGTAGGAGATCTCAGTC CAACCTACTTGACA‑NH2‑3’； 所述的巯基修饰的CP探针的序列为： 5’ ‑GGTAGGTATTAGTCTCAG GC‑SH‑3’； 所述的OH2探针的序列为： 5’ ‑TGAGACTA ATACCGCATTCCCATTAGGCGGTATGTGGAAACTAATGGGAAT‑3’； 所述的OH1探针的序列为： 5’ ‑CATAACCTTTCCACATACCGCCTAATGGGAATGCGGTATGTGGAAA‑3’； 所述的NH1探针的序列为： 5’ ‑TAATACCTACCATCTTGGACTGAGATCTC CTACTTGACAAGATCTCAGTC CAA‑3’。 2.根据权利要求1所述的构建方法， 其特 征在于： 所述 步骤S1具体如下： S1‑1： 将柠檬酸和乙二胺溶于超纯 水中， 充分搅拌混合后得到澄清无色的混合溶 液； S1‑2： 将步骤S1 ‑1获得的混合溶液转移到高压反应 釜中， 在200℃反应5  h， 自然冷却至 室温后透析， 得到水 溶性碳量子点； S1‑3： 使用EDC和NHS活化碳量子点表面的羧基， 再加入氨基修饰 的NH2探针， 通过形成 酰胺键使碳量子点与NH2探针结合， 经过离心再分散获得碳量子点标记的NH2探针， 即为 CDs‑NH2； 其中， 所述的碳 量子点与NH2探针的摩尔比为1  : 1。 3.根据权利要求1所述的构建方法， 其特 征在于： 所述的步骤S2具体如下： S2‑1： 使用氧化铝抛光粉打磨Au电极并超声清洗， 将Au电极置于0.5  mol/L稀硫酸溶液 中进行连续循环 伏安扫描， 获得表面活化的Au电极； S2‑2： 将1  µL 10  µM修饰有巯基的CP探针溶于9   µL含5 mM TCEP的Tris ‑HCl缓冲液中， 滴加到步骤S2 ‑1得到的Au电极表面， 在37  ℃下孵育3小时， 通过金硫键使修饰有巯基的CP 探针结合到Au电极上； S2‑3： 滴加10   µL 1 mM 6‑巯基‑1‑己醇溶液于步骤S2 ‑2得到的Au电极上， 以封闭电极 表面未结合位点； S2‑4： 滴加10   µL 0.4  µM的OH2探针到步骤S2 ‑3得到的Au电极上， 通过碱基互补配对使 OH2探针杂交到电极表面的CP探针上， 即得到OH2探针占据CP探针自由结合端的Au电极。 4.根据权利要求1所述的构建方法， 其特 征在于： 所述的步骤S3具体如下：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115058489 A 2S3‑1： 在1×NEBuffer  2缓冲液中将待测样品和OH1探针、 NH1探针、 和CDs ‑NH2混合， 将 步骤S2得到后的Au电极浸泡在其中， 在37  ℃下孵育5~60分钟， 以进行电极表 面的催化发夹 组装反应； S3‑2： 以含K2S2O8的PBS缓冲液作为电化学发光工作液， 由步骤S3 ‑1获得的Au电极作为 工作电极来构建三电极系统， 使用CHI660电化学工作 站和BPCL微弱发光仪组成电化学发光 检测系统进行测量并采集电化学发光信号， 进 而完成所述电化学传感器的构建。 5.根据权利要求5所述的构建方法， 其特征在于： 所述的OH1探针、 NH1探针和CDs ‑NH2的 摩尔比为1  : 1 : 1。 6.根据权利要求5所述的构建方法， 其特征在于： 所述的电化学发光工作液为含有10   mM K2S2O8的PBS缓冲液， 其中PBS缓冲液的浓度为10  mM、 pH=7.4。 7.根据权利要求5所述的构建方法， 其特征在于： 所述三电极系统组成为： 步骤S3 ‑1获 得的Au电极作工作电极， 铂丝电极作对电极， Ag/AgCl电极作参比电极。 8.根据权利要求5所述的构建方法， 其特征在于： 所述施加于三电极系统 的电位区间为 0 V至‑1.3 V， 扫速为0.1  V/s， 微弱发光仪光电倍增管电压为 ‑1000 V。 9.一种基于串联催化发夹组装技术的双靶标核酸序列响应的电化学传感器， 其特征在 于： 采用权利要求1~8任一所述构建方法构建得到 。 10.根据权利要求9所述的一种基于串联催化发夹组装技术的双靶标核酸序列响应的 电化学传感器的应用， 其特征在于： 在检测新型冠状病毒SARS ‑CoV‑2中的应用； 所述应用为 在非疾病诊断和治疗中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115058489 A 3