(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210725040.7 (22)申请日 2022.06.24 (66)本国优先权数据 202210242681.7 202 2.03.11 CN (71)申请人 郑州大学 地址 450000 河南省郑州市二七区大 学北 路40号 申请人 河南申友医学检验所有限公司 (72)发明人 郭建成　占闽宁　尚文俊　冯帅升　 朱丹丹　孙晓晓　张悦　史健翔　 许红恩　刘海芳　薛夏　张静　 王丙顺　柳丹华　秦亚平　薛滨雨　 (74)专利代理 机构 北京卫智易创专利代理事务 所(普通合伙) 16015 专利代理师 朱春野(51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6881(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 基于三代测序平台的I类HLA 基因扩增引物、 试剂盒及分型方法 (57)摘要 本发明公开了基于三代测序平台的I类HLA 基因扩增引物、 试剂盒及分型方法； 扩增引物包 括： HLA‑A基因正向扩增引物HLA ‑A_F1、 HLA ‑A_ F2， 以及HLA ‑A基因反向扩增引物HLA ‑A_R1、 HLA ‑ A_R2、 HLA ‑A_R3； HLA ‑B基因正向扩增引物HLA ‑B_ F1、 HLA‑B_F2、 HLA ‑B_F3， 以及HLA ‑B基因反向扩 增引物HLA‑B_R1、 HLA ‑B_R2； HLA ‑C基因正向扩增 引物HLA‑C_F1、 HLA ‑C_F2、 HLA ‑C_F3， 以及HLA ‑C 基因反向扩增引物HLA ‑C_R1、 HLA ‑C_R2； 基于中 国人群数据库设计， 包含HLA ‑A、 HLA‑B、 HLA‑C基 因的外显子及内含子， 能够对中国人群I类HLA 基 因进行更好的扩增， 通过三代测序平台进行全长 测序， 得到超高分辨 率的基因分型。 权利要求书3页 说明书12页 序列表4页 附图1页 CN 114854737 A 2022.08.05 CN 114854737 A 1.基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物， 其特 征在于， 包括： (1)HLA‑A基因正向扩增引物HLA ‑A_F1、 HLA ‑A_F2， 以及HLA ‑A基因反向扩增引物HLA ‑A_ R1、 HLA‑A_R2、 HLA ‑A_R3； (2)HLA‑B基因正向扩增引物HLA ‑B_F1、 HLA ‑B_F2、 HLA ‑B_F3， 以及HLA ‑B基因反向扩增 引物HLA‑B_R1、 HLA‑B_R2； (3)HLA‑C基因正向扩增引物HLA ‑C_F1、 HLA ‑C_F2、 HLA ‑C_F3， 以及HLA ‑C基因反向扩增 引物HLA‑C_R1、 HLA‑C_R2； 其中， 所述HLA ‑A_F1的序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述HLA‑A_F2的序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述HLA‑A_R1的序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述HLA‑A_R2的序列如SEQ  ID NO:4所示； 所述HLA‑A_R3的序列如SEQ  ID NO:5所示； 所述HLA‑B_F1的序列如SEQ  ID NO:6所示； 所述HLA‑B_F2的序列如SEQ  ID NO:7所示； 所述HLA‑B_F3的序列如SEQ  ID NO:8所示； 所述HLA‑B_R1的序列如SEQ  ID NO:9所示； 所述HLA‑B_R2的序列如SEQ  ID NO:10所示； 所述HLA‑C_F1的序列如SEQ  ID NO:11所示； 所述HLA‑C_F2的序列如SEQ  ID NO:12所示； 所述HLA‑C_F3的序列如SEQ  ID NO:13所示； 所述HLA‑C_R1的序列如SEQ  ID NO:14所示； 所述HLA‑C_R2的序列如SEQ  ID NO:15所示。 2.根据权利要求1所述的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物， 其特 征在于： 所述HLA‑A基因正向扩增引物HLA ‑A_F1与HLA ‑A_F2摩尔比为1:1， 所述HLA ‑A基因反向 扩增引物HLA ‑A_R1、 HLA‑A_R2、 HLA ‑A_R3的摩尔比为1:1:1； 所述HLA‑B基因正向扩增引物HLA ‑B_F1、 HLA ‑B_F2、 HLA ‑B_F3的摩尔比为1:1:1， 所述 HLA‑B基因反向扩增引物HLA ‑B_R1、 HLA‑B_R2的摩尔比为1:1； 所述HLA‑C基因正向扩增引物HLA ‑C_F1、 HLA ‑C_F2、 HLA ‑C_F3的摩尔比为1:1:1， 所述 HLA‑C基因反向扩增引物HLA ‑C_R1、 HLA‑C_R2的摩尔比为1:1。 3.基于三代测序平台的I类HLA基因扩增及测序试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1或 2所述的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物。 4.根据权利要求3所述的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增及测序试剂盒， 其特征 在于， 还包括PCR扩增试剂、 测序文库构建试剂以及基因纯化试剂。 5.基于三代测序平台的I类HLA基因分型 方法， 其特 征在于， 包括： (1)利用权利要求3或4所述的I类HLA基因扩增及测序试剂盒构建三代测序文库； (2)在三代测序平台进行 上机测序； (3)测序完成后对测序数据进行分析， 确定分型 结果。 6.根据权利要求5所述的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法， 其特征在于， 构建 三代测序文库具体包括：权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114854737 A 2(1‑1)利用基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物对目标样品进行扩增， 得到扩增 物； (1‑2)得到的扩增物进行纯化、 末端修饰、 接头连接和文库扩增反应， 构建得到三代测 序文库。 7.根据权利要求6所述的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法， 其特征在于， (1 ‑ 1)中对目标样品进行扩增的程序设定为： 95℃， 5mi n； 95℃， 30s； 65℃， 30s； 72℃， 3mi n 30s进行35个循环； 72℃， 10mi n。 8.根据权利要求6所述的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法， 其特征在于， 扩增 反应的反应 体系为： 9.根据权利要求6所述的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法， 其特征在于， 构建 三代测序文库的试剂配置为： 10.根据权利要求5所述的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法， 其特征在于， 在 测序完成后对测序数据进行分析， 具体包括： (3‑1)利用NanoFilt将三代测序平台测序所得的fastq序列进行数据质控， 得到clean   data的fastq文件； (3‑2)通过minimap2软件与人参考基因组进行比对分析， 得到长片段比对结果的bam文 件； (3‑3)利用samtools软件根据bam文件中HLA ‑A、 HLA‑B、 HLA‑C基因的位置对bam文件进 行拆分， 分别得到 HLA‑A基因、 HLA ‑B基因、 HLA ‑C基因的fastq文件； (3‑4)利用Canu软件分别对HLA ‑A基因、 HLA‑B基因、 HLA ‑C基因的fastq序列进行序列校 正和截取； (3‑5)将校正和截取过后序列按照序列长度进行排序选取最长的30条序列进行权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114854737 A 3