(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210662391.8 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 首都医科 大学附属北京佑安医院 地址 100069 北京市丰台区右安门外西头 条8号 (72)发明人 任锋　张向颖　徐玲　田原　 范子豪　曹亚玲　高耀　段钟平　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 董函竹 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于PCR-CRISPR-Cas13a检测HDV-RNA的试 剂盒 (57)摘要 本发明公开了基于PCR ‑CRISPR‑Cas13a检测 HDV‑RNA的试剂盒。 具体地公开了用于检测丁型 肝炎病毒RNA的组合物， 所述组合物包括引物对 和crRNA， 所述crRNA的序列由用于与Cas13a蛋白 结合的锚定序列和靶向丁型肝炎病毒RNA逆转录 的cDNA靶序列的向导序列组成， 所述向导序列为 SEQ ID No.1的第40 ‑67位。 本发明还公开了用于 检测HDV‑RNA的试剂盒、 检测方法。 本发明检测方 法特异性强， 灵 敏度高， 能够实现对HDV ‑RNA水平 的稳定检测并且评价药物的治疗效果， 改善丁肝 患者的抗病毒治疗， 疗效评估， 预后监测等方面 的问题， 为实现丁肝的个体化治疗奠定坚实的基 础。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图3页 CN 114908195 A 2022.08.16 CN 114908195 A 1.用于检测丁型肝炎病毒RNA的组合物， 其特征在于， 所述组合物包括引物对和crRNA， 所述crRNA的核苷酸序列由用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向丁型肝炎病毒RNA逆 转录的cDNA靶序列的向导序列组成， 所述向导序列为SEQ  ID No.1的第40 ‑67位。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述crRNA的核苷酸序列为SEQ  ID  No.1。 3.根据权利要求1或2所述的组合物， 其特征在于， 所述引物对由引物F和引物R组成， 所 述引物F为SEQ  ID No.2所示的单链DNA分子； 所述引 物R为SEQ  ID No.3所示的单链DNA分 子。 4.用于检测丁型肝炎病毒RNA的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1 ‑3中 任一项所述的组合物。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括Cas13a蛋白和/或报 告RNA。 6.权利要求1或2中所述的crRNA或权利要求1或2中所述的crRNA与Cas13a蛋白的复合 物。 7.权利要求3中所述的引物F和/或引物R。 8.一种检测丁型肝炎病毒RNA的方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： A1)提取待测样本RNA； A2)将所述RNA反转录成cDNA， 以所述cDNA为模板， 利用权利要求3中所述的引物F和引 物R进行PCR扩增， 得到扩增产物； A3)利用CRIS PR‑Cas13a检测体系对所述扩增产物进行检测； 所述CRIS PR‑Cas13a检测体系包括权利要求1或2中所述的crRNA。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas13a检测体系还包括 Cas13a蛋白和/或转录酶。 10.权利要求1‑3中任一项所述的组合物， 和/或， 权利 要求6所述的cr RNA， 和/或权利 要 求3中所述的引物F和/或引物R的下述任一种应用： B1)在检测丁型肝炎病毒RNA或制备用于检测丁型肝炎病毒RNA的产品中的应用； B2)在研究HDV致病机制或者制备用于研究HDV致病机制的产品中的应用； B3)在筛选丁肝药物或者制备用于 筛选丁肝药物的产品中的应用； B4)在评价 丁肝患者药物疗效或者制备用于 评价丁肝患者药物疗效的产品中的应用； B5)在制备诊断或辅助诊断丁型肝炎病毒感染所引起的疾病的产品中的应用； B6)在制备筛查或辅助筛查 丁型肝炎病毒感染所引起的疾病的产品中的应用； B7)在丁型肝炎病毒防控中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908195 A 2基于PCR‑CRISPR‑Cas13a检测HDV ‑RNA的试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及病毒检测领域中基于PCR ‑CRISPR‑Cas13a检测HDV ‑RNA的试剂盒。 背景技术 [0002]丁型肝炎病毒(Hepatitis  D virus， HDV)是导致人类丁型肝炎的病原体， 其病毒 颗粒呈球形， 直径约为35～36nm。 HDV的基因组为共价闭合环状单负链RNA， 全长仅约1.7kb， 是目前已知的对人类致病的病毒中基因组最小的。 HDV是一种缺陷病毒， 不能独立复制， 必 须通过乙型肝炎病毒(Hepatitis  B virus， HBV)的辅助才能增殖。 HDV一般可通过与HBV联 合感染(co ‑infection)或慢性乙型肝炎患者重叠感染(super ‑infection)导致急性或慢性 丁型肝炎。 在HBV与HDV合并感染者中， 15％的患者可在1～2年内进展为肝硬化， 70％～8 0％ 的患者可在5～10年内进展为肝硬化。 同时， 研究显示HBV/HDV 合并感染的患者， 其肝癌发生 率比单纯的HBV感染高2～3倍。 2017年， 世界卫生组织(World  Health Organization， WHO) 发布的全球肝炎报告(WHO  global hepatitis report)特别强调， 目前HDV的疾病负担仍不 明确， 亟待进一步调查研究。 目前研究报道的HDV感染流行率不一， 提示我国目前真实的HDV 感染流行病学情况仍 不清楚， 这与检测试剂的灵敏度和特异度密切相关。 [0003]目前， HDV感染检测方法的局限性是丁型肝炎病毒感染被显著低估的重要原因之 一。 目前一般通过检测HDV抗原(HDV ‑Ag)、 HDV抗体(HDV ‑Ab)和HDV  RNA来诊断HDV感染。 (1) HDV‑Ag检测： 存在血清学检测窗口期短， 检测方法灵敏不高的缺点， 目前已经较少使用； (2) HDV‑Ab检测： IgM被认为是HDV感染中具有代表性的标志物之一， 而且其清除效率与疾病的 疗效紧密相关， IgG在HDV感染后会持续存在， 被认为是HDV既往感染的血清学标志。 但是多 种厂家生产的ELISA检测试剂盒质量参差不齐， 且检测成本较高， 假阳性率与假阴性率较 高， 临床应用受到一定的限制； (3)HDV  RNA检测： HDV  RNA阳性被认为是诊断HDV感染的 “金 标准”， 并且可以评估患者的感染状态， 指导抗病毒治疗。 随着RT ‑PCR技术的广泛应用， 采用 定性或半定量分析， HDV检测的灵敏度显著提高， 定量PCR时HDV  RNA检测限为1000个基因 组/mL， 巢式PCR能达到10个基因组/mL。 尽管RT ‑qPCR检测具有快速、 方便、 特异等优点， 但 是， 由于HDV  RNA中GC含量和互补性高， 给HDV扩增带来了巨大的技术挑战， 目前RT ‑PCR是应 用最多的HDV  RNA检测方法， 但是由于HDV  RNA的广泛遗传变异性， 迄今为止尚无完全标准 化的PCR检测技 术。 [0004]近年来， 基因编辑技术发展迅速， 不同亚型的CRISPR ‑Cas的基因编辑系统拓展了 临床检测、 基础研究和生物医学领域方面的应用。 目前已知的5种CRISPR ‑Cas系统可以根据 发挥作用的构成核酸蛋白酶的亚基的特点分为两大类： 一类系统(Class  1)和二类系统 (Class 2)。 其中， CRISPR ‑Cas13a系统是第二类( Ⅵ型)的CRISPR ‑Cas系统， 依 赖于含有两个 HEPN(Higher  eukaryotes  and prokaryotes  nucleotide ‑binding domains， HEPN)结构域 的单效应子作为核酸蛋白酶， 如Cas13a。 Cas13a是第二大类VI型系统中的效应蛋白， 具有 RNA介导的RNA酶切活性， 它能够特异性靶向切割单链RNA， 并在切割后仍保持活性， 继续切 割其他非靶标RNA， 这种特性被称为 “附带切割(collateral  cleavage) ”。 利用Cas13a的这说　明　书 1/9 页 3 CN 114908195 A 3