(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210707317.3 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 青岛农业大 学 地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路 700号 (72)发明人 褚栋　杨力凤　董兆克　陶云荔　 国栋　 (74)专利代理 机构 山东三邦知识产权代理事务 所(普通合伙) 37308 专利代理师 牛继梅 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) (54)发明名称 基于LAMP方法的苹果蠹蛾鉴别引物组、 鉴别 方法及鉴别试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种基于LAMP方法的苹果蠹 蛾鉴别引物组、 鉴别方法及鉴别试剂盒， 属于农 业害虫鉴别技术领域。 本发明基于LA MP方法的苹 果蠹蛾鉴别引物组， 是根据SEQ  IDNO:1所示核 酸 序列设计而成； 采用该引物组， 以待测昆虫的全 基因组DNA或部分组织为模板， 进行LA MP反应； 反 应结束后， 检测是否有扩增产物； 若有扩增， 则待 测昆虫为苹果蠹蛾。 本发明用快速分子检测加可 视化方法鉴别苹果蠹蛾， 在1小时内获得检测结 果。 免开盖的可视化检测方法可以有效避免气溶 胶污染， 能够准确显色， 显色结果肉眼可见， 不需 要昂贵的仪器设备， 适用于现场、 基层快速鉴别 苹果蠹蛾。 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 附图2页 CN 114891788 A 2022.08.12 CN 114891788 A 1.一种基于LAMP方法的苹果蠹蛾鉴别引物组， 其特征在于， 根据SEQ  ID NO:1所示核酸 序列设计而成。 2.根据权利要求1所述基于LAMP方法的苹果蠹蛾鉴别引物 组， 其特征在于， 所述引物组 由核苷酸序列为SEQ  ID NO:2的F3引物、 核苷酸序列为SEQ  ID NO:3的B3引物， 核苷酸序列 为SEQ ID NO:4的FIP引物以及核苷酸序列为SEQ  ID NO:5的BIP引物组成。 3.权利要求2所述基于LAMP方法的苹果蠹蛾鉴别引物组在苹果蠹蛾鉴别中的应用。 4.一种鉴别苹果蠹蛾的方法， 其特征在于， 采用权利要求2 的引物组， 以待测昆虫的全 基因组DNA或待测昆虫的部分组织为模板， 进行LAMP反应； 反应结束后， 检测是否有扩增产 物； 若有扩增， 则待测昆虫为苹果蠹蛾。 5.根据权利要求4所述鉴别苹果蠹蛾的方法， 其特征在于， 所述LAMP反应的条件为： 63 ℃45min， 80℃灭活10mi n。 6.根据权利要求4所述鉴别苹果蠹蛾的方法， 其特征在于， 通过向LAMP反应后的体系中 加入核酸染料， 来检测是否有扩增产物。 7.根据权利要求6所述鉴别苹果蠹蛾的方法， 其特征在于， 所述核酸染料的添加方式 为： 在配制好LAMP反应体系后， 在反应管的内部上端设置一个活动的且不与反应体系接触 的隔膜， 并将核酸 染料滴加在隔膜上， 然后盖上盖子进 行反应， 在反应结束后通过离心使隔 膜上的核酸染料混进反应后的体系中， 通过观察显色结果 来判定是否有扩增产物。 8.根据权利要求7所述鉴别苹果蠹蛾的方法， 其特征在于， 所述核酸染料为钙黄绿素或 SYBR Green I。 9.一种基于可视化LAMP技术鉴别苹果蠹蛾的便携试剂盒， 其特征在于， 包含LAMP引物 组， 所述LAMP引物组 由核苷酸序列为SEQ  ID NO:2的F3引物、 核苷酸序列为SEQ  ID NO:3的 B3引物， 核苷酸序列为SEQ  ID NO:4的FIP引物以及核苷酸序列为SEQ  ID NO:5的BIP引物组 成。 10.根据权利要求9所述基于可视化LAMP技术鉴别苹果蠹蛾的便携试剂盒， 其特征在 于， 还包含核酸染料、 Bst  DNA大片段聚合酶、 10 ×ThermoPol缓冲液、 100mmol/L  MgSO4、 10mmol/L的dNTPs 混合液、 5mo l/L的Betai ne、 活动隔膜和恒温工具。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891788 A 2基于LAMP方 法的苹果蠹蛾鉴别引物组、 鉴别方 法及鉴别试 剂盒 技术领域 [0001]本发明属于农业害虫鉴别技术领域， 具体涉及一种基于LAMP方法的苹果蠹蛾鉴别 引物组、 鉴别方法及鉴别试剂盒。 背景技术 [0002]苹果蠹蛾(Cydia  pomonella)属鳞翅目(Lepidoptera)卷蛾科(Tortricidae)。 凭 借自身极强的繁殖能力， 陆续在 全世界70多个国家发生。 对苹 果产区的危害十 分严峻， 是果 业毁灭性的有害生物。 该害 虫寄主范围广， 主要危害苹 果、 梨、 山楂等30多种果树。 主要以幼 虫期进行危害， 蛀果率达到50％以上， 最为严重的可达到70％～100％， 严重影响果品品质， 甚至有的不能食用、 从而失去了应有的经济价值。 由此可见， 做好苹果蠹蛾的监测防控， 杜 绝苹果蠹蛾危害， 是实现高品质、 高效益 果品的重中之重 。 [0003]由于苹果蠹蛾体型较小， 并且在幼虫阶段就开始进行危害， 常隐蔽发生， 对环境、 经济等造成了损失， 从而严重影响了水果生产和国际贸易， 被许多国家和地区列为重要的 进境植物检疫性有 害生物。 [0004]长期以来， 苹果蠹蛾的鉴定主要是基于其形态特征而确定的， 由于生活环境不同， 苹果蠹蛾形态特征会随之发生相应的变化， 给鉴定带来困难。 而且， 在瓜果的检疫过程中， 检测到的通常是苹果蠹蛾幼虫， 通过传统形态学法很难对苹果蠹蛾幼虫进行准确 鉴定， 这 给苹果蠹蛾的检疫防控带来困难。 [0005]目前， 虽然有一些针对苹果蠹蛾的特异性引物识别技术。 例如， 申请号为 201811568937.3的中国专利申请公开苹果蠹蛾特异性SS ‑COII引物及其应用。 设计的引物 可特异性检测苹 果蠹蛾， 在其近缘种、 属蛀果蛾中无扩增产 物。 但是采用P CR技术， 整个过程 需要在5个小时内完成， 耗时长， 过程繁琐。 对于苹果蠹蛾分子检测的方法主要是基于聚合 酶链式反应(PCR)的技术或实时荧光定量(Real ‑time PCR)进行的， 均存在试验周期较长、 操作繁琐、 受检测材料限制、 对实验仪器及检测人员的技术要求高等缺点， 因此难以满足基 层实验室的检测需求。 发明内容 [0006]针对于现有技术中存在的问题， 本 发明的目的在于提供一种基于可视化LAMP 技术 检测苹果蠹蛾的方法及应用。 [0007]为了达到上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0008]一种基于LAMP方法的苹果蠹蛾鉴别引物组， 是根据SEQ  ID NO:1所示核酸序列设 计而成。 [0009]在一个具体的实施例中， 所述引物组由核苷酸序列为SEQ  ID NO:2的F3引物、 核苷 酸序列为SEQ  ID NO:3的B3引物， 核苷酸序列为SEQ  ID NO:4的FIP引物以及核苷酸序列为 SEQ ID NO:5的BIP引物组成。说　明　书 1/7 页 3 CN 114891788 A 3