(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210727672.7 (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 湖南农业大 学 地址 410128 湖南省长 沙市芙蓉区湖南农 业大学 (72)发明人 王爱兵　谭磊　廖帆　雷磊　 段德勇　杨毅　湛洋　王乃东　 雷红宇　邓治邦　王玉格　胡意　 (74)专利代理 机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 431 13 专利代理师 何为　袁颖华 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化检测PCV2 核酸的试剂盒及方法 (57)摘要 一种基于LAMP ‑CRISPR/Cas12a可视化检测 PCV2核酸的试剂盒， 包 括CRPSPR ‑Cas12检测体系 和LAMP扩增引物， 是将LAMP检测方法和CRPSPR ‑ Cas12检测方法相结合， 建立的可实现猪圆环病 毒2型核酸可视化检测方法。 本检测方法具有优 良的特异性、 灵敏性和可重复性， 且操作简便， 无 需昂贵的仪器设备， 并具有可视化优势， 将该检 测方法向猪场及检测单位推广应用， 有利于实现 猪圆环病毒2型相关病的快速诊断。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图6页 CN 115094060 A 2022.09.23 CN 115094060 A 1.一种crRNA， 其特征在于， 其是用于检测猪圆环病毒2型核酸的crRNA， 包括crRNA2 ‑F/ R和crRNA3‑F/R， crRNA2‑F/R序列如SEQ  ID NO.9和SEQ  ID NO.10所示， cr RNA3‑F/R序列如 SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。 2.一种猪圆环病毒2型CRISPR/Cas12a检测体系， 其特征在于， 其包括LbCas12a蛋白、 crRNA和s sDNA探针， crRNA序列如权利要求1所述， s sDNA序列如SEQ  ID NO.13所示。 3.如权利要求2所述的检测体系， 其特征在于， 所述LbCas12a蛋白与crRNA的浓度比为 1： 1。 4.如权利要求2所述的检测体系， 其特 征在于， 所述s sDNA探针浓度为2 μM 。 5.一种可视化检测猪圆环病毒2型核酸的试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求2 ‑4中 任一项所述的CRIS PR/Cas12a检测体系。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括扩增所述核酸的引物。 7.如权利要求6所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述引物包括如下引物对： F3/B3， 如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示； FIP/BIP， 如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示； LF/LB， 如SEQ  ID NO.5和SEQ  ID NO.6所示。 8.一种可视化检测猪圆环病毒2型核酸的方法， 其特征在于， 该方法是利用LAMP扩增引 物扩增所述核酸， 再将扩增产物加入到 CRISPR/Cas12a检测体系中检测所述核酸。 9.如权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 所述 LAMP扩增引物包括如下引物对： F3/B3， 如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示； FIP/BIP， 如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示； LF/LB， 如SEQ  ID NO.5和SEQ  ID NO.6所示。 10.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述CRISPR/Cas12a检测体系包括LbCas12a 蛋白、 crRNA和s sDNA探针， crRNA序列如权利要求1所述， s sDNA序列如SEQ  ID NO.13所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094060 A 2基于LAMP ‑CRISPR/Cas12a可视化检测PCV2核酸 的试剂盒及 方法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 涉及 猪圆环病毒2 型的检测， 具体涉及一种将LAMP检测 方法和CRPSPR ‑Cas12检测方法相结合实现猪圆环病毒2型核酸的快速可视化检测试剂盒及 方法。 背景技术 [0002]猪圆环病毒2型(porcine  circovirus  type 2,PCV2)是导致断奶仔猪多系统衰竭 综合征、 猪呼吸疾病综合征、 猪皮炎和肾病综合征等疾病的主要病原。 P CV2感染可抑制生猪 免疫系统， 使 得PCV2与其它病原混合 感染， 且混合 感染引发的临床特征差异较大， 导致PCV2 临床诊断困难， 继而给养猪业造成巨大的经济损失。 快速、 准确且及时的早期诊断对于P CV2 的防控尤为重要， 但传统的检测方法不仅需要昂贵的仪器设备， 而且方法 复杂， 需要专 业人 士操作， 还无法实现可视化检测， 不利于病原现场诊断。 因此， 建立一种适合于现场诊断 PCV2核酸的检测方法将有利于该病的防控。 [0003]规律成簇间隔的短回文重复序列(Clustered  regularly  interspaced  short  palindromic  repeats,CRISPR)是由一系列重复DNA序列及间隔序列组成， 与CRISPR相关蛋 白(CRISPR  associatedp rotein,Cas)组成CRISPR/Cas系统， 其广泛存在于 古细菌和许多细 菌中， 是原核生物应对外来核酸入侵的重要免疫机制。 最近研究表明， CRISPR/Cas系统不但 已广泛应用于基因编辑， 且可作为核酸检测的新型方法， 在病原检测方面具有较强的应用 性。 目前多种Cas蛋白可在sgRNA引导下有效切割靶基因序列， 其中Cas12a蛋白也具有优异 的靶基因序列特异性识别能力和高效的反式切割活性。 因此， 可利用Cas12a蛋白被靶向激 活的特性， 实现对靶标单链DNA的特异 性检测。 目前已有的核酸快速检测方法包括环介导等 温扩增技术(LAMP)和 重组酶聚合酶扩增法(RPA)等， 此类方法需较昂贵的仪器或特殊等温 仪器， 且高速扩增过程中易造成假阳性。 而CRISPR/Cas12a系统在此类恒温扩增方法的基础 上加入了特异性切割检测， 无疑在提高检测方法的灵敏性的同时又能避免假阳性。 [0004]因此， 利用LAMP技术和 CRISPR/Cas12a技术实现一种快速检测PCV2相关病的方法 迫在眉睫。 发明内容 [0005]本发明的目的在于， 针对上述现有技术的不足， 提供一种基于LAMP ‑CRISPR/ Cas12a可视化检测猪圆环病毒2型的试剂盒及检测方法， 以期能实现PCV2相关疾病的早期 防控。 [0006]为达上述目的， 本发明所采用的技术方案是： 一种crRNA， 其是用于检测猪圆环病 毒2型核酸的cr RNA， 包括crRNA2 ‑F/R和crRNA3 ‑F/R， crRNA2 ‑F/R序列如SEQ  ID NO.9和SEQ  ID NO.10所示， crRNA3 ‑F/R序列如SEQ  ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。 [0007]本发明又提供一种猪圆环病毒2型CRISPR/Cas12a检测体系， 其包括LbCas12a蛋说　明　书 1/8 页 3 CN 115094060 A 3