(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210677922.0 (22)申请日 2022.06.15 (71)申请人 湖南工程学院 地址 411104 湖南省湘潭市福星东路8 8号 (72)发明人 张何　杨苑　杨梅　张培柔　傅昕　 (74)专利代理 机构 长沙伊柏专利代理事务所 (普通合伙) 4326 5 专利代理师 罗莎 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/682(2018.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌 检测探针组及其检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种基于DNA zyme双循环体系 的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法， 该 检测探针组包括发夹型探针H1、 发夹型探针H2、 信号链S3和Pb2+， 发夹型探针H1和发夹型探针H2 均为茎环结构且均含有8 ‑17DNAzyme碱基序列， 发夹型探针H1环部区中心位置和信号链S3中心 位置均有8 ‑17DNAzyme特异性切割位点； 发夹型 探针H1连接有与牛结核分枝杆菌靶序列互补的 碱基序列和引发链； 发夹型探针H2包含有与引发 链、 信号链S3互补的碱基序列。 本发明检测探针 将Pb2+依赖型8‑17DNAzyme作为双循环信号放大 体系的中心元件， 实现牛结核杆菌检测 信号高效 放大的目的， 同时本方法不依赖胞内酶系， 能够 在体外进行检测筛选， 实现对牛结核分枝杆菌 DNA的快速高灵敏检测。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图5页 CN 115011713 A 2022.09.06 CN 115011713 A 1.一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组， 其特征在于， 包括发夹 型探针H1、 发夹型探针H2、 信号链S3和Pb2+； 所述发夹 型探针H1和发夹型探针H2均为茎环结构， 所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均 含有8‑17DNAzyme碱基序列， 所述发夹型探针H1环部区中心位置和信号链S3中心位置均有8 ‑ 17DNAzyme 特异性切割位 点； 所述发夹型探针H1的茎部区游离3 ’端和环部区分别连接有a1区和b1区， 所述a1区和b1区 分别为与牛结核分枝杆菌靶序列 5’端和3’端互补的碱基序列， 所述发夹型探针H1还包含有 引发链序列； 所述发夹型探针H2的环部区包含有与所述引发链互补的碱基序列， 所述发夹型探针H2 的游离3’端和茎部互补区分别连接有a2区和b2区， 所述a2区和b2区分别为与所述信号链S3的 5’端和3’端互补的碱基序列； 所述信号链S3的两端分别连接有荧 光基团和荧 光淬灭基团。 2.根据权利 要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组， 其特 征在于， 所述a1区基因序列如SEQ  ID NO.1所示： GTCTGCACA； 所述b1区基因序列如SEQ  ID  NO.2所示： TAGTC CTCT。 3.根据权利 要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组， 其特 征在于， 所述a2区基因序列如SEQ  ID NO.3所示： AACTAAGA； 所述b2区基因序列如SEQ  ID  NO.4所示： GA ACTATCT。 4.根据权利 要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组， 其特 征在于， 所述发夹型探针H1的基因序列如SEQ  ID NO.5所示： GGATCAAAAATAGTCCTCTACTrAGTCTTTTTTTTTGATCCGAGCCGGACGAAGTGTCTGCACA， 该序列中 rA为RNA碱基， 为特异性切割位 点； 所 述 牛 结 核 分 枝 杆 菌 靶 序 列 的 基 因 序 列 如 S E Q  I D N O .8 所 示 ： TGTGCAGACG GAGAGGACTAGAT TTGTCAGA。 5.根据权利 要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组， 其特 征在于， 所述发夹型探针H2的基因序列如SEQ  ID NO.6所示： GGAGATAGTTCAGTAGAGGACTATT TTTGATAAGAACTATCTC CGAGCCGGACGAAACTAAGA； 所述信号链S3的基因序列如SEQ  ID NO.7所示： TCTTAGTTrAGGATAGTT， 该序列中rA为RNA 碱基， 为特异性切割位 点。 6.根据权利 要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组， 其特 征在于， 所述 荧光基团为FAM基团， 所述 荧光淬灭基团为BHQ基团。 7.一种如权利 要求1～6任一项所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测 探针组的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 探针序列预处理： 将探针H1、 H2和信号链S3的冻干粉用缓冲溶液溶解， 然后对探针H1、 H2进行退火以形成茎环结构； S2、 双循环体系反应： 取步骤S1中的缓冲溶液、 退火后的探针H1、 H2溶液与待检测样品混 合加入EP管中混合均匀， 然后避光加入信号链S3溶液混合反应， 一 步构建双循环反应 体系； S3、 荧光值测定： 将步骤S2混合反应液在黑暗条件下用荧光计进行检测， 并记录下荧光权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115011713 A 2值， 通过荧 光值判断待检测物是否含有牛 结核分枝杆菌； 所述缓冲溶 液含有Pb2+。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述缓冲液包括Tris ‑HCl、 NaCl和 PbCl2。 9.根据权利 要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤S1中退火温度设置为:95℃, 5min； 85℃,5min； 70℃,15min； 65℃,15min； 50℃,15min； 40℃,15min； 30℃,15min； 25℃, 90min。 10.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤S3中荧光计的激发波长为 470nm。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115011713 A 3