(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210568717.0 (22)申请日 2022.05.24 (71)申请人 吉林大学 地址 130000 吉林省长 春市前进大街269 9 号 申请人 斯慧生物科技 （吉林） 有限公司 (72)发明人 莫小兵　杜金格　毕明芳　朱刚　 吴薛琴　 (74)专利代理 机构 苏州国诚专利代理有限公司 32293 专利代理师 李小叶 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测 方法及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种基于CRISPR系统进行71 型肠道病毒的检测方法， 包括如下步骤： 步骤一， 以待测样品中EV71病毒核 酸样本为模板， 利用反 转录等温扩增技术扩增目标片段， 得到扩增产 物； 步骤二， 向扩增产物中加入Cas12a/crRNA复 合物， 在crRNA介导下进行特异性切割反应； 步骤 三， 在步骤二反应后的反应体系中加入含有DNA 探针的缓冲液进行孵育， 得到待测反应液； 将待 测反应液滴加至胶体金试纸条样品垫上， 观察检 测线和质控线的显色情况， 判断是否含有待测病 原。 本发明还公开了一种7 1型肠道病毒的检测试 剂盒。 该检测方法和试剂盒可实现对7 1型肠道病 毒的快速检测， 具有特异性好、 灵敏度高和检测 成本低等特点。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图3页 CN 115216562 A 2022.10.21 CN 115216562 A 1.一种非疾病的诊断目的的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法， 其特征在 于， 包括如下步骤： 步骤一， 以待测样品中EV71病毒核酸样本为模板， 利用反转录等温扩增技术并采用特 异性引物扩增目标片段， 得到扩增产物； 步骤二， 向步骤一所得的扩增产物中加入Cas12a/crRNA复合物， 在cr RNA介导下进行特 异性切割反应； 步骤三， 在步骤二反应后的反应体系中加入含有DNA探针的缓冲液进行孵育， 得到待测 反应液； 将待测反应液滴加 至胶体金试纸条样 品垫上， 等待5 ‑10min， 观察检测线和质控线 的显色情况， 判断是否含有 待测病原。 2.根据权利 要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法， 其特征在于， EV71病毒核酸样本为： 待测EV71病毒核酸的DNA全长或片段、 待测EV71病毒核酸的PCR产物 或恒温扩增产物。 3.根据权利 要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法， 其特征在于， 所述特异性引物的核苷酸序列如Seq  ID NO.2和Seq  ID NO.3所示。 4.根据权利 要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法， 其特征在于， crRNA的序列为与待测EV71核酸特异性结合的序列； 且crRNA是针对EV71 ‑VP1的3段保守序 列设计得到 。 5.根据权利 要求4所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法， 其特征在于， crRNA包含如Seq ID NO.4、 Seq ID NO.5、 Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。 6.根据权利 要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法， 其特征在于， DNA探针为FAM基团和Biotin基团双标记 的单链DNA探针； 且所述DNA探针的核苷酸序列如 Seq ID NO.7所示。 7.根据权利 要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法， 其特征在于， 步骤一中的扩增反应是在23℃ ‑45℃条件下进行等温扩增10 ‑15min； 步骤二的反应是在37 ℃条件下反应10 ‑20min； 步骤三的孵 育过程是在37℃条件下孵 育10‑15min。 8.一种单链DNA探针， 其两端分别利用FAM基团和Biotin基团进行双标记， 且其核苷酸 序列如Seq  ID NO.7所示。 9.一种71型肠道病毒的检测试剂盒， 其特征在于， 包括crRNA、 Cas12a蛋白、 10 ×缓冲 液、 单链DNA探针、 试纸条缓冲液和胶体金试纸条； 所述单链DNA探针的两端分别利用FAM基 团和Biotin基团进行双标记， 且其核苷酸序列如Seq  ID NO.7所示。 10.根据权利 要求9所述的一种71型肠道病毒的检测试剂盒， 其特征在于， crRNA包含如 Seq ID NO.4、 Seq ID NO.5、 Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115216562 A 2基于CRISPR系统进行 71型肠道病毒 的检测方 法及试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于核酸检测技术领域， 特别涉及一种基于CRISPR系统进行71  型肠道病 毒的检测方法及试剂盒。 背景技术 [0002]手足口病(Hand,Foot  and Mouth Disease， HFMD)是由肠道病毒引发的  常见儿童 传染病， 常发于五岁以下 儿童， 以发热、 口腔溃疡、 手、 脚及臀部  的水疱性皮疹为主要表现， 一年四季均可发病， 尤以夏秋季节最为多 见， 是 世界范围内流行范围较广的学龄前 儿童常 见急性传染病， 具有传播速度快，  传染率高等特点， 易导致聚集性疫情出现。 HFMD的传染源 包括患者、 病毒  携带者及隐性感染者， 其中隐性感染者在疾病散发期间还是重要的传染 源。 由于患者 唾液、 粪便及疱疹液中均含有大量病毒， 可通过呼吸道、 消化道及  密切接触 等方式迅速传播。 [0003]HFMD由肠道病毒引起； 引发HFMD的肠道病毒有20多种， 主要为柯  萨奇病毒 (Coxasckie  virus： A组4、 5、 7、 9、 10、 16型， B组2、 5、 13型)，  埃可病毒(ECHO  viruses)和肠 道病毒68 ‑71型(EV68 ‑71)。 其中， 以EV7 1 及柯萨奇病毒A16型(CA16)最为 常见。 EV7 1感染与 CA16感染在HFMD  流行期间交替出现， 或共同存在， 成为HFMD的主要病原学因素。 在诊断   HFMD病例的病原学因素中， EV71占44％， CA16占25％。 其中， 重症病例  中EV71阳性占74％， 死亡病例中EV71阳性占93％。 因此， EV71是导 致HFMD 重症和死 亡的主要病原。 [0004]EV71感染常导致严重的神经系统症状。 病毒从咽部或肠道侵入后， 在局  部黏膜或 淋巴组织中繁殖； 病毒 可引起局部症状， 继而 又侵入淋巴结， 并由  此进入血液循环， 导致病 毒血症。 病毒经血循环侵入网状内皮组织、 深层淋  巴结、 肝、 脾、 骨髓等处大量繁殖并由此 进入血液循环， 再次引起病毒血症。  此后， 病毒随血流进入全身各器官， 如中枢神经系统、 皮肤黏膜、 心脏等处，  进一步繁殖并引起病变。 感染EV71后， 出现血管变态反应和组织炎症 病变。 当病毒累及中枢神经系统 时， 组织炎症较神经毒性作用更加强烈， 中枢神经  系统小 血管内皮最易受到损害。 细胞融合、 血管炎性病变、 血栓形成可导致  缺血和梗死。 在脊髓 索、 脑干、 间脑、 大脑和小脑的局部组织中， 除嗜神经  性作用外， 还存在广泛的血管周围和 实质性细胞炎症。 [0005]EV71感染临床表现特点多样化： 从无症状的隐性感染， 普通HFMD和  咽峡炎等轻症 病例， 到神经源性肺水肿和呼吸衰竭等重症患儿， 甚至死亡。  诊断肠道病毒EV71型感染目 前主要依赖病毒核酸检测和病毒分离培养， 部分  基层医院和疾病 预防控制中心缺 乏相应 条件， 部分重症病例临床上并无典型  的HFMD表现。 所以， 在疫情暴发初期重症病例常常难 以明确诊断， 常被诊  断为肺炎。 只有 结合病例的流行病学调查、 临床表现， 特别是实验室检 测结 果， 才有可能进行明确诊断。 目前， 检测 HFMD的方法主要采用病毒分离培  养、 胶体金 试纸条、 病毒 中和试验、 RT ‑PCR和ELISA法等。 其中， EV71分  离培养周期长、 价格 昂贵、 灵敏 度低、 对设备要求高。 胶体金试纸条法虽然  简单快捷， 但灵敏度稍低。 RT ‑PCR灵敏度和特异 性均较高， 且采样方便、 检  测时间较 短， 可作为EV71早期感染的诊断。 但此方法对实验环 境说　明　书 1/6 页 3 CN 115216562 A 3