(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211243747.0 (22)申请日 2022.10.11 (71)申请人 广西壮族自治区水产科 学研究院 地址 530000 广西壮 族自治区南宁市青秀 区青山路8号 (72)发明人 韦信贤　童桂香　黄光华　吴铁军　 谭红连　陈福艳　黄婷　 (74)专利代理 机构 佛山知正知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 44483 专利代理师 李亚婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹 彩病毒1的方法 (57)摘要 本发明公开了同时检测罗氏沼虾野田村病 毒和十足目虹彩病毒1的方法， 包括引物与探针 设计及合成、 病毒核酸提取及标准品制备、 二重 荧光定量PCR退火温度优 化、 二重荧光定量PCR检 测体系优化、 标准曲线建立及敏感性试验、 特异 性实验、 复性试验和样品核酸提取与检测。 本发 明结合TaqMan ‑MGB探针技术建立的二重荧光定 量PCR能同时检测MrNV和DIV1， 且具有灵 敏度高、 特异性强、 重复性好、 简便快速的特点， 可为WTD 和DIV1D的临床诊断及实时监测提供技术保障， 实现对罗氏沼虾WTD和DIV1D的快速诊断及科学 防控， 为虾苗检疫、 亲虾筛选及疾病诊断等提供 更高效的技 术手段。 权利要求书2页 说明书8页 附图4页 CN 115478120 A 2022.12.16 CN 115478120 A 1.同时检测罗氏沼虾野田村病 毒和十足 目虹彩病 毒1的方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： S1， 引物与探针设计及合成： 采用Primer  Express v3.0分别在MrNV ‑CP基因和DIV1 ‑ MCP基因的保守区域设计多组特异性引物和TaqMan ‑MGB探针， 并进行合成； 其中， MrNV和 DIV1探针的5'端分别标记HEX和FAM荧光染料、 3'端均标记MGB基团， 获得扩增引物和探针， 并制作扩增引物及探针序列信息表， 具体如下， 然后， 对扩增引物及探针序列信息表中的扩增引物及探针进行预实验测试筛选， 筛选 出一套效果较好的引物及探针进行使用； S2， 病毒核酸提取及标准品制备： 取阳性病料组织按1:2的比例加入生理盐水， 然后， 匀 浆、 离心收集2 00.0 μL上清液， 分别提取MrNV、 DIV1、 WSSV、 IHHNV和EHP的核 酸， 最后加50.0 μL 洗脱缓冲液溶解， 病毒DNA置于 ‑20℃冰箱保存， 病毒RNA置于 ‑70℃冰箱保存； 制备重组质粒 pGM‑T‑CPMrNV和pGM‑T‑MCPDIV1； 提取pGM ‑T‑CPMrNV质粒DNA， 以SalI单酶切使质粒线性化后采 用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化； 以线性 化pGM‑T‑CPMrNV 质粒DNA为模板， T7体外转录试剂盒体外转录获得的RNA为检测MrNV的标准品RNA， 而 pGM‑T‑MCPDIV1质粒DNA则直接作为检测DIV1的标准品DNA； 使用核酸蛋白分析仪分别测定 MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA的纯度和浓度， 并换算成拷贝数： 拷贝数(Copies/μL)＝ 6.02×1023×(ng/ μL×10‑9)÷(RNA长度 ×340)/(DNA长度 ×660)； 采用10倍梯度稀释， 将 标准品系列稀释成1.0 ×101～1.0 ×108Copies/ μL， ‑40℃保存备用； S3， 二重荧光定量PCR退火温度优化： 参考各引物的退火温度， 以1.0 ×108、 1.0×105、 1.0×101Copies/ μL3个浓度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA等比例混合液为模板， 按1 ℃的梯度在58～62℃范围内分别进行二重荧光定量PCR扩增， 获得MrNV和DIV1二重荧光定 量PCR的扩增曲线， 并将可以获得较低Ct值及较高相对荧光强度增加值时的退火温度选为 最佳退火稳温度； S4， 二重荧光定量PCR检测体系优化： 选择1.0 ×108、 1.0×105、 1.0×101Copies/ μL3个 不同浓度的标准品RNA/DNA为模板， 先进行单个病毒检测体系优化， 再以浓度为1.0 × 105Copies/ μL的2种标准品等比例混合液为模板， 进行二重荧光定量PCR检测体系优化， 获 得优化后的引物和探针浓度， 且为 最佳的引物和探针浓度；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115478120 A 2S5， 标准曲线建立及敏感性试验： 取2.0μL 的10倍梯度系列稀释MrNV标准品RNA和DIV1 标准品DNA同梯度等比例混合液(1.0 ×101～1.0 ×108Copies/ μL)为模板， 以优化后的二重 荧光定量PCR进行扩增， 每个梯度设3个平行， 建立Mr NV和DIV1二重荧光定量PCR的标准曲线 和标准方程， 以及获得二重荧 光定量PCR检测MrNV的敏感性曲线， 判断方法的敏感性； S6， 特异性实验： 运用优化后的二重荧光定量PCR对MrNV、 DIV1、 WSSV、 IHHNV和EHP的核 酸进行检测， 观察有无 出现扩增曲线及Ct值， 评价方法的特异性； S7， 重复性试验： 以1.0 ×107、 1.0×106、 1.0×105Copies/ μL3个梯度的MrNV标准品RNA 和DIV1标准品DNA同梯度等比例混合液为模板， 分别在第1d、 第7d和第14d进行重复试验， 每 个梯度设3个平行； 计算组内及组间Ct值的变异系数(CV)， 评价标准品和方法的稳定性 S8， 样品核酸提取与检测： 取罗氏沼虾临床样品组织按1:2的比例加入生理盐水， 然后， 匀浆、 离心收集200.0 μL上清液， 提取核酸， 最后加50.0 μL洗脱缓冲液溶解， 获得核酸样本， 然后， 使用经步骤S4优化获得的二重荧光定量P CR， 在经步骤S3确定的最佳退火稳温度 环境 下， 对核酸样本进行扩增， 观察核酸样本是否有扩增曲线， 判断核酸样本中是否有MrNV、 DIV1的核酸。 2.根据权利要求1所述的同时检测罗氏沼虾野田村病 毒和十足目虹彩病 毒1的方法， 其 特征在于， 在步骤S6中， MrNV、 D IV1的核酸出现扩增曲线及Ct值， WSSV、 IHHNV和EHP的核酸未 出现扩增曲线及Ct。 3.根据权利要求1所述的同时检测罗氏沼虾野田村病 毒和十足目虹彩病 毒1的方法， 其 特征在于， 在步骤S8中， 以Ct值为35作为界限， 当Ct值≤35且有扩增曲线， 判定为MrNV或DIV1 阳性； Ct值＞35同时有扩增曲线， 需重复检测1次， 若结果一致判定为MrNV或DIV1阳性， 重复 结果无扩增曲线则判定为MrNV或DIV1阴性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115478120 A 3