(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210571115.0 (22)申请日 2022.05.24 (71)申请人 武汉珈创生物技 术股份有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新二路388号武汉光谷国际生 物医药企业加速器3.1期4栋1层、 2层、 3层 (72)发明人 张若璇　王明珍　徐国东　袁冰　 郝瑶　韩玲玲　 (74)专利代理 机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 专利代理师 吴慧珺 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的 引物及探 针组合物、 检测方法、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明属于病毒检测技术领域， 具体提供了 一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的 引物及探针组合物， 包括检测小鼠微小病毒的引 物和探针， 检测小鼠胸腺病毒的引物和探针。 本 发明还提供了包括上述引物及探针组合物的试 剂盒， 以及同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病 毒的方法。 本发明提供的这种引物及探针组合 物、 试剂盒及方法可以特异性扩增出MVM和MTLV 这两种病毒， 且不与其它病毒核酸发生交叉反 应， 也不会与样本中可能存在的各种常用细胞系 基因组发生交叉反应， 特异性良好、 敏感性高、 重 复性好， 弥补了现有技术中小鼠微小病毒和小鼠 胸腺病毒必须分别进行检测的短板， 为啮齿类动 物生物制 品的外源病毒污染防控提供了良好的 检测手段。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 114934136 A 2022.08.23 CN 114934136 A 1.一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物， 包括检测小鼠微 小病毒的上游引物P ‑MVM‑F、 下游引物P ‑MVM‑R和探针MVM ‑P， 检测小鼠胸腺病毒的上游引物 P‑MTLV‑F、 下游引物P ‑MTLV‑R和探针MTLV ‑P， 其特征在于： 所述上游引物P ‑MVM‑F的序列为5 ’ ‑AACTTACTTCTTCTGCTGCACA ‑3’； 所述下游引物P ‑MVM‑R的序列为5 ’ ‑AGACCCAGTAGAAACACCAACC‑3’； 所述探针MVM ‑P的序列为5 ’ ‑(FAM)‑CCAACCTGA/iXNA_C /RGCGRAAACG‑(BHQ)‑3’； 所述上游引物P ‑MTLV‑F的序列为5 ’ ‑AGGACTTGCTTTACCTGTTG‑3’； 所述下游引物P ‑MTLV‑R的序列为5 ’ ‑ATACATAC CTCTCCAAGAACCG‑3’； 所述探针MTLV ‑P的序列为5 ’ ‑(FAM)‑CCAACCTGA/iXNA_C /RGCGRAAACG‑(BHQ)‑3’； 其中/iXNA_A/表示对碱基A进行锁核酸修饰； /iXNA_T/表示对碱基T进行锁核酸修饰； / iXNA_G/表示对碱基G进行锁核酸 修饰； /iXNA_C /表示对碱基C进行锁核酸 修饰。 2.一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包 括如权利要求1所述的引物及探针组合物； 所述上游引物P ‑MVM‑F、 所述下游引物P ‑MVM‑R、 所述上游引物P ‑MTLV‑F和所述下游引物P ‑MTLV‑R混合后形成混合引物， 所述探针MVM ‑P和 所述探针MTLV ‑P混合后形成混合探针。 3.如权利要求2所述的同时检测小鼠微小病 毒和小鼠胸腺病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 所述混合引物中所述上游引物P ‑MVM‑F的浓度为0.1 ‑1mM， 所述下游引物P ‑MVM‑R的浓度为 0.1‑1mM， 所述上游引物P ‑MTLV‑F的浓度为0.1 ‑1mM， 所述下游引物P ‑MTLV‑R的浓度为0.1 ‑ 1mM。 4.如权利要求2所述的同时检测小鼠微小病 毒和小鼠胸腺病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 所述混合探针中所述探针MVM ‑P的浓度为0.0 5‑1mM， 所述探针MTLV ‑P的浓度为0.0 5‑1mM。 5.如权利要求2所述的同时检测小鼠微小病 毒和小鼠胸腺病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 还包括QPCR反应预混液。 6.如权利要求2所述的同时检测小鼠微小病 毒和小鼠胸腺病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 还包括定量标准品； 所述定量标准品为PUC 57‑MVM和PUC 57‑MTLV质粒混合物。 7.如权利要求2所述的同时检测小鼠微小病 毒和小鼠胸腺病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 还包括阳性对照； 所述阳性对照为灭活的MVM毒株和MTLV假病毒 毒株混合物。 8.如权利要求1所述的引物及探针组合物或如权利要求2 ‑7任意一项所述的试剂盒在 检测啮齿类生物制品中小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒污染的应用。 9.一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的荧光定量QPCR方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： (1)提取待测样本的DNA模板； (2)利用如权利要求1所述的引物及探针组合物对DNA模板进行荧 光定量QPCR反应； (3)待测样品Ct值≤35， 且有明显的扩增曲线时， 判定待测 样本小鼠微小病毒和小鼠胸 腺病毒为阳性。 10.如权利要求9所述的同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的双重荧光定量QPCR 方法， 其特征在于： 所述步骤(2)中QPCR扩增程序为9 5℃， 10min； 9 5℃、 15s， 55℃、 30s， 72℃、 20s， 41个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934136 A 2同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒 的引物及 探针组合 物、 检测方 法、 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于病毒检测技术领域， 涉及同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引 物和探针组合物及其应用， 具体涉及一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的双重荧 光定量QPCR检测引物和探针组合物、 检测方法、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]随着重组蛋白类药物在医疗领域的广泛应用， 生物制品的病毒安全问题也备受重 视， 啮齿类动物细胞系如中国仓鼠卵巢细胞系(CHO ‑K1细胞)常用于蛋白质表达生产系统， 以保证产品的正确构象和活性， 然而无论是生物活性原材料还是复杂的生产操作过程， 都 不可避免地存在病毒污染的风险。 [0003]小鼠微小病毒(murine  minute virus， MVM)为单链DNA病毒， 无囊膜， 有极强的稳 定性， 易感染啮齿类动物细胞， 如CHO ‑K1、 BHK21细胞等。 小鼠胸腺病毒Thymic  Virus(MTLV； murid herpesvirus  3)属于疱疹病毒科， 病毒颗粒直径约为135nm， 是一种 含包膜的DNA病 毒， 可感染并杀死新生小鼠胸腺内发育中的T淋巴细胞， 属于一种实验动物 易感病原体。 ICH   Q5A明确规定， MVM和MTLV作为啮齿类动物细胞系中的物种特异性病毒， 需要进行外源因子 污染检测。 常用于MVM和MTLV的检测方法为病毒分离、 ELISA抗原检测、 RT ‑PCR核酸检测， 相 比之下荧 光定量QPCR检测方法更直观、 快速， 适 合早期病毒安全风险把控。 [0004]目前样本中的小鼠微小病毒和小鼠胸 腺病毒必须分别进行两个荧光定量QPCR检 测， 检测过程费工 费时的技术， 且市面上缺乏可同时检测MVM和 MTLV的检测方法和试剂盒， 为此， 本发明提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的双重荧光定量QP CR检测 引物和探针组合物、 检测方法、 试剂盒， 解决了检测过程费工费时的问题。 发明内容 [0005]本发明的目的是克服现有技术中小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒必须分别进行检 测的问题。 [0006]为此， 本发明提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针 组 合物， 包括检测 小鼠微小病毒的上游引物P ‑MVM‑F、 下游引物P ‑MVM‑R和探针MVM ‑P， 检测小 鼠胸腺病毒的上游引物P ‑MTLV‑F、 下游引物P ‑MTLV‑R和探针MTLV ‑P； [0007]所述上游引物P ‑MVM‑F的序列为5 ’ ‑AACTTACTTCTTCTGCTGCACA ‑3’； [0008]所述下游引物P ‑MVM‑R的序列为5 ’ ‑AGACCCAGTAGAAACACCAACC‑3’； [0009]所述探针MVM ‑P的序列为5 ’ ‑(FAM)‑CCAACCTGA/iXNA_C /RGCGRAAACG‑(BHQ)‑3’； [0010]所述上游引物P ‑MTLV‑F的序列为5 ’ ‑AGGACTTGCTTTACCTGTTG‑3’； [0011]所述下游引物P ‑MTLV‑R的序列为5 ’ ‑ATACATAC CTCTCCAAGAACCG‑3’； [0012]所述探针MTLV ‑P的序列为5 ’ ‑(FAM)‑CCAACCTGA/iXNA_C /RGCGRAAACG‑(BHQ)‑3’； [0013]其中/iXNA_A/表示对碱基A进行锁核酸修饰； /iXNA_T/表示对碱基T进行锁核酸修说　明　书 1/6 页 3 CN 114934136 A 3