(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211297732.2 (22)申请日 2022.10.22 (71)申请人 贵州省畜牧兽医研究所 地址 550005 贵州省贵阳市南明区小碧乡 老里坡 (72)发明人 余波　姜玲玲　李婷　周景瑞　 许浩翔　冉江　罗文菊　刘镜　 (74)专利代理 机构 贵州派腾知识产权代理有限 公司 521 14 专利代理师 朱雪琼 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三重RT-PCR方法及应用 (57)摘要 本发明公开了可同时检测牛病毒性腹泻病 毒、 轮状病毒、 冠状病毒 的三重RT ‑PCR方法及应 用， 包括以下步骤： 以牛淋巴结、 肠道黏膜和病毒 的RNA为RNA模板， 以牛病毒性腹泻病毒(SEQ  ID  NO.1， 187bp)、 牛轮状病毒(SE Q IDNO.2， 391bp)、 牛冠状病毒(SEQ  ID NO.3， 725bp)三种病毒的遗 传特征设计了特异性上游引物和特异性下游引 物作为特异性引物， 进行RT ‑PCR扩增得到扩增产 物， 检测结果， 判断待测样品中是否含有牛病毒 性腹泻病毒、 牛轮状病毒、 牛冠状病毒。 本发明特 异、 敏感、 快速、 可 同时检测BVDV、 BRV和BCoV3种 RNA病毒的多重RT ‑PCR检测方法。 权利要求书2页 说明书8页 附图4页 CN 115491438 A 2022.12.20 CN 115491438 A 1.可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三重RT ‑PCR方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： 以牛淋巴结、 肠道黏膜和病毒的RNA为RNA模板， 参考GenBank中BVDV  5'‑ UTR、 BRV VP6和BCoVN基因序列， 以牛病毒性腹泻病毒、 牛轮状病毒、 牛冠状病毒三种病毒的 遗传特征设计了特异 性上游引物和特异 性下游引物作为特异 性引物， 进 行RT‑PCR扩增得到 扩增产物， 检测结果， 判断待测样品中是否含有牛病毒性腹泻病毒、 牛轮状病毒、 牛冠状病 毒。 2.根据权利要求1所述的可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三重 RT‑PCR方法， 其特征在于： 所述RT ‑PCR扩增采用37℃、 10min转录完成的逆转录酶混合物， 所 述逆转录酶混合物包括： pH值为8.3的100mM  Tris‑HCl、 10mM  MgCl2、 10mM DTT、 50mM  KCl、 0.5mM dTTP、 0.4MBq/mL[3 H]‑dTTP、 1mM poly(A)oligo(dT)12 ‑18和逆转录酶。 3.根据权利要求1所述的可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三重 RT‑PCR方法， 其特征在于： 所述牛病毒性腹泻病毒长度为187bp， 上游引物如SEQ  ID NO.1的 F1所示， 下游引物如SEQ  ID NO.1的R1所示； 所述牛轮状病毒长度为391bp， 上游引物如SEQ  ID NO.2的F2所示， 下游引物如SEQ  ID  NO.2的R2所示； 所述牛冠状病毒长度为725bp， 上游引物如SEQ  ID NO.3的F3所示， 下游引物如SEQ  ID  NO.3的R3所示。 4.根据权利要求1或2所述的可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三 重RT‑PCR方法， 其特 征在于： 所述RT ‑PCR扩增包括单一RT ‑PCR扩增和三重RT ‑PCR扩增。 5.根据权利要求4所述的可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三重 RT‑PCR方法， 其特征在于： 所述单一RT ‑PCR扩增体系为： 25 μL单一病毒的RT ‑PCR反应体系中 上下游引物各为1.0μL， 2 ×1Step Buffer 12.5μLPrimeScript  One Step Enzyme Mix为 1.0 μL， 模板1.0 μL。 6.根据权利要求4所述的可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三重 RT‑PCR方法， 其特征在于： 所述单一RT ‑PCR扩增反应条件为： 3 7℃、 10min； 9 5℃、 5min； 94℃、 30s， 预设50.0℃、 53.0℃、 56.0℃、 59.0℃、 62.0℃共5个退火温度进行优化30s， 72℃、 45s， 共进行30个循环； 72℃、 10mi n。 7.根据权利要求4所述的可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三重 RT‑PCR方法， 其特征在于： 所述三重RT ‑PCR扩增反应体系： 50μL体系的BVDV、 BRV和BCoV的 RT‑PCR反应体系中上下游引物分别各为2.0μL， 2 ×1Step Buffer 25.0μL， PrimeScript   One Step Enzyme Mix为4.0 μL， 模板1.0 μL。 8.根据权利要求4所述的可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三重 RT‑PCR方法， 其特征在于： 所述三重RT ‑PCR扩增反应条件为： 3 7℃、 10min； 9 5℃、 5min； 94℃、 30s， 预设48.0℃、 50.0℃、 52.0℃、 54.0℃、 56.0℃、 58.0℃、 60.0℃共5个退火温度进行优 化 30s， 72℃、 45s， 共进行3 0个循环； 72℃、 10mi n。 9.根据权利要求4所述的可同时检测牛病毒性腹泻病毒、 轮状病毒、 冠状病毒的三重 RT‑PCR方法， 其特征在于： 所述BVDV、 BRV和BCoV核酸最低检测浓度分别为BVDV是2 50ng/mL、 BRV是250ng/mL和BcoV是25ng/mL。 10.根据权利要求1～9所述的可同时检测牛病 毒性腹泻病 毒、 轮状病 毒、 冠状病毒的三权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115491438 A 2重RT‑PCR方法的应用， 其特征在于： 所述三重RT ‑PCR方法用于牛腹泻致病原的检测、 牛场腹 泻病原定期监测以及牛腹泻流行病 学调查； 所述牛腹泻致病原为牛病毒性腹泻病毒、 牛轮 状病毒、 牛 冠状病毒中的一种或一种以上。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115491438 A 3