(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210584441.5 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 中国农业科 学院郑州果 树研究所 地址 450009 河南省郑州市管城回族区未 来路南 (72)发明人 王然　齐秀娟　方金豹　林苗苗　 钟云鹏　李思凯　 (74)专利代理 机构 北京尚钺知识产权代理事务 所(普通合伙) 11723 专利代理师 王海荣 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 30/10(2019.01) G16B 20/20(2019.01)G16B 40/00(2019.01) (54)发明名称 包含7个分子标记的预测猕猴桃果实干物质 含量的分子标记组及其应用和试剂盒 (57)摘要 本发明属于猕猴桃遗传育种及分子标记技 术领域， 涉及包含7个分子标记的预测猕猴桃果 实干物质含量的分子标记组及其应用和试剂盒， 本分子标记组由7个与猕猴桃果实干物质含量 QTL紧密连锁的分子标记组成。 通过检测本发明 中提供的与果实干物质含量相关的分子标记， 可 以在苗期进行选择， 筛选出具有高果实干物质含 量QTL的猕猴桃品种或品系用于育种， 不仅节约 育种成本， 而且 大大提高了猕猴桃优异品种的选 育效率。 此外， 本发明分子标记位置明确， 检测方 法简便易行， 不受环境影响， 可快速准确地筛选 出果实干物质含量高的优良单株， 有助于提高产 品品质和商业价值， 提升猕猴桃产业的经济效 益， 同时为猕猴桃种质创新和品种改良提供有益 的技术支撑。 权利要求书3页 说明书7页 序列表5页 CN 115141893 A 2022.10.04 CN 115141893 A 1.包含7个分子标记的预测猕猴桃果实干物质含量的分子标记组， 其特征在于， 所述的 分子标记组由7个与猕猴桃果实干物质含量QTL紧密连锁的分子标记组成， 所述7个分子标 记的序列如SEQ  ID NO:1‑7所示， 所述7个分子标记的名称、 染色体位置、 上游引物序列、 下 游引物序列如下： 分子标记1， 名称为GWZ ‑PT‑2， 位于染色体group14的2941531处， 分子标记1的上游引物 序列为 ： 5 ' ‑TCACTGTTATTGTTCTGTTCCCTTAG ‑3 '， 下游引物序列为 ： 5 ' ‑ TAGACAATGGTCGCCCAAAAC‑3'； 分子标记2， 名称为GWZ ‑PT‑5， 位于染色体group21的12905943处， 分子标记2的上游引 物 序 列为 ： 5 ' ‑T G T T A C A G A T T G A T C C C G T T A ‑3 '， 下 游 引物 序 列 为 ： 5 ' ‑ AAGTTTTCTACATTAGGAAGTCATC‑3'； 分子标记3， 名称为GWZ ‑PT‑9， 位于染色体group21的13362919处， 分子标记3的上游引 物 序 列为 ： 5 ' ‑A G T G C T T G G T G C T T G C C T A T G ‑3 '， 下 游 引物 序 列 为 ： 5 ' ‑ GTAGCAGCA ACCATCATGA AAAAC‑3'； 分子标记4， 名称为GWZ ‑PT‑17， 位于染色体group21的14104997处， 分子标记4的上游引 物序列为： 5' ‑AGCCTCGTAAA CCTGAAATAG ‑3'， 下游引物序列为： 5' ‑TTCACTATTATGGCAAGGGTC ‑ 3'； 分子标记5， 名称为GWZ ‑PT‑20， 位于染色体group21的15099785 处， 分子标记5的上游引 物 序 列为 ： 5 ' ‑G G G A C C C A C T A T A C T T G A A A A ‑3 '， 下 游 引物 序 列 为 ： 5 ' ‑ CAAACACTTATGTGACAGCA AT‑3'； 分子标记6， 名称为GWZ ‑PT‑29， 位于染色体group17的19534169处， 分子标记6的上游引 物序列为 ： 5 ' ‑GACAGAGAGAGGATGGAGAGGTTG ‑3 '， 下游引物序列为 ： 5 ' ‑ ATTTCCCATCTCCGTTGCTTC‑3'； 分子标记7， 名称为GWZ ‑PT‑27， 位于染色体group17的18922713 处， 分子标记7的上游引 物序列为： 5 ' ‑GCGAATACTTTAGGTTTGAGTTGTT ‑3 '， 下游引物序列为： 5 ' ‑ GCCTTTTGGTAATTGGACGAA‑3'。 2.根据权利要求1所述的分子标记组 的筛选方法， 其特征在于， 所述筛选方法包括以下 步骤： (1)使用两种不同中华猕猴桃杂交亲本构建F1群体， 选择F1群体的子代单株为研究对 象； (2)采集上述F1群体的子代单株叶片， 利用CTAB法提取总DNA， 根据RADseq方法构建上 述中华猕猴桃杂交亲本及其子代的文库并测序； (3)对测序数据进行过滤； 使用比对软件BWA采用mem算法将过滤后的reads比对到参考 基因组上， 比对参数为 ‑k 32‑M； 比对完成后结果使用 软件picard进行标记； 然后以群体 RAD‑tags集合为参考， 使用变异检测软件GATK进行群体SNP检测， 统计多态 性位点在群体中 的遗传类型， 获得基因型列表； 最后对获得的基因型列表进行 过滤； (4)使用Lep ‑MAP3软件的OrderMarkers2模块， 计算上步过滤后的基因型列表中各标记 间的遗传距离和各个染色体的图距， 构建高密度遗传图谱， 获得标记间的遗传位置和标记 到各个遗传位置的LOD值的矩阵； (5)在果实成熟期， 对上述中华 猕猴桃杂交F1群 体的果实进行干物质含量测定；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115141893 A 2(6)将上述果实样本的干物质含量数据和标记的基因型数据导入R， 使用R/qtl的 scanone()函数对各个性状进行区间作图， 扫描步长为1cm， 使用LOD＝2.5作为阈值筛选 QTL， 最终筛选得到3个与果实干物质含量相关的QT L， 分别在Lach esis_group14、 Lach esis_ group17、 Lac hesis_group21， 对该性状的贡献率分别为2 9.5％、 9.5％和23.2％； (7)分别提取上述与果实干物质含量相关的QTL在猕猴桃基因组上的物 理位置， 获得了 7个分子标记， 其序列如SEQ  ID NO:1‑7所示， 设计上述7个分子标记的上游引物序列、 下游 引物序列、 扩增产物大小和退火温度； (8)利用PCR扩增 和Sanger测序技 术对上述 果实样品进行分型及验证； (9)经上述步骤将中华猕猴桃杂交F1群体的子代分为两类基因型， 对两类基因型杂交 子代个体的平均果实干物质含量进行显著性检验， 显示两类基因型个体的平均果 实干物质 含量差异极显著， 验证了所获得的分子标记组可用于预测猕猴桃果实干物质含量的差异。 3.根据权利要求2所述的分子标记组的筛选方法， 其特征在于， (3)步中所述对测序数 据进行过滤， 其过滤方法如下： (a)去除低质量碱基含量大于 50％的序列； (b)去除有测序接 头污染的reads； (c)去除大量重复的reads。 4.根据权利要求2所述的分子标记组的筛选方法， 其特征在于， (3)步中所述对获得的 基因型列表进行 过滤， 其过滤方法如下： (a)去除分型比例低于10％的位 点； (b)去除杂合比例大于75％的位 点； (c)按理论比对标记位点的基因型比例进行卡方检验， p值小于0.001的位点视为严重 偏分离位 点并去除； (d)保留分离类型为 lmxll、 nnxnp和hkxhk的标记， 去除其 余标记类型。 5.根据权利要求2所述的分子标记组的筛选方法， 其特征在于， (4)步中所述Lep ‑MAP3 软件的OrderMarkers2模块的参数设置为： identicalLimit＝0.01， minError＝0.001， sexAvera ged＝0， i nformativeMask ＝123， use Kosambi＝1， 其他参数使用默认值。 6.根据权利 要求2所述的分子标记组的筛选方法， 其特征在于， (8)步中所述利用PCR扩 增和Sanger测序技 术对上述 果实样品进行分型及验证， 包括： (a)按照Yeasen  Biotechnology， 2xHieff  Canace Plus PCR Master Mix说明， 设计反 应体系， 反应体系包括： 5ng/μl‑1猕猴桃基因组DNA模板3μl、 2xHieff  Canace Plus PCR  Master Mix 25 μl、 根据权利要求1记载的各标记的上游引物和下游引物各2 μl、 ddH2O补足 至50 μl； (b)扩增程序为： 98℃预变性3mi n； 98℃变性10s， 退火20s， 72℃延伸3 0s， 进行3 5个循环； 72℃终延伸5mi n， 4℃保存； (c)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳， 针对扩增出的符合目的片段大小 的条带 切胶进行胶回收； (d)纯化产物用Sanger测序技 术验证分型准确性。权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115141893 A 3