(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210610762.8 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 益善生物技 术股份有限公司 地址 510663 广东省广州市高新 技术产业 开发区科学城揽月路8 0号广州科技创 新基地B、 C区第五层 (72)发明人 许嘉森　吴诗扬　刘芳　刘志明　 (74)专利代理 机构 广州广典知识产权代理事务 所(普通合伙) 44365 专利代理师 万志香 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 人BMP3和NDRG4基因甲基化检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及了一种人BMP3和NDRG4基因甲基 化检测试剂盒， 该试剂盒包括酶切反应液， 所述 酶切反应液包含酶切缓冲液、 甲基化依赖型限制 性内切酶， 还包括针对BMP3基因和/或NDRG4基因 的CpG岛分别设计的引物和部分双链线性DNA探 针的荧光PCR反应液。 本发明所述检测试剂盒能 够实现在一管中依次进行酶切反应和荧光PCR反 应以检测BMP3和NDRG4基因甲基化状态， 具有操 作简单快速、 灵敏度高、 特异性好、 易于自动化的 特点。 权利要求书1页 说明书16页 序列表3页 附图2页 CN 114807373 A 2022.07.29 CN 114807373 A 1.人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括酶切反应 液， 所述酶切反应液包 含甲基化依赖型限制性内切酶； 还包括针对BMP3基因和/或NDRG4基因的CpG岛分别设计 的引物和部分双链线性DNA探 针的荧光PCR反应液； 其中， 每种基因的所述部分双链线性DNA探针包含一条碱基数长的荧光探针和一条碱 基数短的淬灭探针； 所述荧光探针5 ’端标记有荧光报告基团， 3 ’端标记有荧光淬灭基团； 所 述淬灭探针与荧光探针的5 ’端完全互补， 3 ’端标记有荧光淬灭基团； 针对不同基因的荧光 报告基团不同。 2.根据权利要求1所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 针对 BMP3基因的引物如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.2所示， 和/或针对 NDRG4基因的引物如SEQ  ID  NO.5至SEQ ID NO.6所示。 3.根据权利要求1所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 针对 BMP3基因的探针包括如SEQ  ID NO.3所示的荧光探针和如SEQ  ID NO.4所示的淬灭探针； 和/或针对NDRG4基因的探针包括如SEQ  ID NO.7所示的荧光探针和SEQ  ID NO.8所示的淬 灭探针。 4.根据权利要求1所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 所述 甲基化依赖型限制性内切酶选自Msp JI、 FspEI和LpnPI任意一种； 优选地， 所述甲基化依赖 型限制性内切酶为MspJI。 5.根据权利要求4所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 所述 MspJI用量 为1～2U/反应； 更优选地， 所述MspJI用量 为1.5U/反应。 6.根据权利要求1所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 所述 酶切反应液还包含酶切缓冲液、 酶活性液和无核酸酶的水； 所述酶活性液为含有双链寡核 苷酸的Tris ‑HCl缓冲液， 所述双链寡核苷酸为茎环结构， 包含两个甲基化位点； 优选地， 所 述双链寡核苷酸序列如SEQ  ID NO.13所示。 7.根据权利要求6所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 所述 酶活性液在反应时的双链寡核苷酸的浓度为15 0±1nM， 和/或 所述酶切缓冲液为含有50 ±2mM醋酸钾、 20 ±1mM Tris‑醋酸、 10±1mM醋酸镁和100 ±5 μg/ml重组白蛋白的水 溶液。 8.根据权利要求1所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 所述 荧光PCR反应液还包含PCR缓冲液、 dNTP、 DNA聚合酶、 甜菜碱、 四甲基氯化铵和无核酸酶的 水； 所述甜菜碱在荧光PCR反应液中的浓度为100mM～150mM； 优选地， 所述甜菜碱的浓度为 125±5mM。 9.根据权利要求8所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 所述 四甲基氯化铵在荧光PCR反应液中的浓度为10 mM～20mM； 优选地， 所述四甲基氯化铵的浓度 为15±1mM。 10.根据权利要求1所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 所 述酶切反应液和荧光PCR反应液通过热熔材料分层包装在同一PCR扩增管内， 优选地， 所述 热熔材料为熔点70℃～72℃的全精炼石蜡。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807373 A 2人BMP3和NDRG4基因甲 基化检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 具体涉及一种人BMP3和NDRG4基因甲基化检测试剂盒。 技术背景 [0002]表观遗传程序的紊乱是结直肠癌发生的重要原因(Liu  R et al.,Mutat  Res, 2019,779:45 ‑57)。 DNA甲基化 改变是最重要的表观遗传变化， 控制着特定基因的转录和表 达， 在结直肠癌发生中起着 重要作用。 在癌变的早期和晚期， 甲基化基因的沉默经常发生在 腺瘤‑癌级联的局灶性病变中。 因此， 甲基化改变驱动了结直肠癌的发生和进展。 基因甲基 化检测可能有助于识别早期结直肠癌个 体， 可能有助于改善疾病结局。 [0003]BMP3， 即骨形态发生蛋白3， 其基因编码转化生长因子β(TGF ‑β )超家族蛋白的分泌 配体， 在骨形成中具有重要功能。 BMP3基因甲基化可在多种肿瘤中被检测到， 包括结直肠 癌、 胰腺癌、 胃癌、 肺癌、 乳腺癌和胆 管癌(Kisiel JB et al.,J Mol Biomark Diagn,2013, 4:1000145)。 在结直肠癌中， BMP3基因异常甲基化可下调BMP3表达， BMP3失活是结直肠癌发 生的早期和常见事件(Loh  K et al.,Genes  Chromosomes Cancer,2 008,47:449 ‑60)。 研究 表明， 粪便样 本BMP3甲基化诊断结直肠癌的总体灵敏度和特异性分别为70％和89％(Liu  R  et al.,Mutat  Res,2019,7 79:45‑57)。 [0004]NDRG4， 即N ‑Myc下游调控基因4， 为NDRG基因家族成员， 其参与细胞增殖、 分化、 发 育和应激(Shi  HH et al.,BMB Rep,2020,53:658 ‑663)。 NDRG4在人类恶 性肿瘤中发挥着 多 种作用(Shi  HH et al.,BMB Rep,2020,53:658 ‑663)。 在胶质母细胞瘤中， NDRG4起着癌 基 因的作用， 其对星形胶质细胞的存活至关重要； 在 恶性脑膜瘤中， NDRG4通过抑制p53表达抑 制细胞凋亡而起到致癌作用。 但是， NDRG4在其它肿 瘤如结直肠癌、 胃癌、 乳腺癌、 胰腺癌中 具有抑癌作用。 NDRG4启动子甲基化可在胃癌、 结直肠癌、 乳 腺癌和胰腺癌中被检测到， 并可 导致NDRG4表达下调。 研 究表明， NDRG4甲基化诊断结直肠癌的总体灵敏度和特异性分别为 76％和82％(L iu R et al.,Mutat  Res,2019,7 79:45‑57)。 [0005]鉴于BMP3和NDRG4分别对结直肠癌筛查具有较高的诊断价值， 近年来联合检测 BMP3和NDRG4基因甲基化在结直肠癌诊断中的应用也备受关注。 研究表明， 粪便样 本中BMP3 和NDRG4基因甲基化状态的联合是一个非常有用的标志物， 其诊断结直肠癌的灵敏度和特 异性分别达89％和87％(Liu  R et al.,Mutat  Res,2019,779:45 ‑57)。 可见， 联合检测BMP3 和NDRG4基因甲基化在结直肠癌筛查中具有更好的诊断性能。 [0006]目前BMP3和NDRG4基因甲基化检测的方法主要为基于亚硫酸氢盐转化的荧光PCR 法。 该方法是利用亚硫酸氢盐对DNA样本进行处理， 将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶， 然 后以经亚硫酸氢盐处理后的DNA样本为模板， 利用特异性引物和荧光探针进行荧光PCR， 根 据检测荧光信号以判断甲基化状态， 如中国专利申请CN201510486088 .7和 CN201710090789.8。 上述两项中国专利申请所述试剂盒虽然具有较好的灵敏度和/或特异 性， 但却未能解决亚硫酸氢盐转化带来的缺陷， 如： 转化条件剧烈易造成DNA样本降解； 转化 后需DNA纯化和回收， 操作步骤繁琐； 转化不完全可能造成检测结果偏倚； 等。 因此， 有必要说　明　书 1/16 页 3 CN 114807373 A 3