(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210748999.2 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 赵春青　张苏贵　满文韬　李瑶　 罗光华　韩召军　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 徐冬涛　杜静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 二化螟GAB A受体RDL1亚基A282S突变的分子 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种二化螟GABA受体RDL1亚 基A282S突变的分子检测方法， 所述方法为提取 单头二化螟幼虫基因组DNA； 设计两对特异性引 物； 建立LA MP反应体系； 明确LA MP反应程序； 确定 反应结果的颜色判定标准。 本发明具备特异性 强、 稳定性好、 灵敏度高、 操作简便、 用时短等优 点， 可为田间二化螟的抗药性监测和抗药性早期 预警提供技术支持， 为二化螟的科学防治、 合理 选药提供准确的判定标准， 更适用于基层植保检 测的需要。 本技术旨在解决二化螟GAB A受体RDL1 亚基A282S突变的快速分子检测， 并由此判断二 化螟是否对苯基吡唑类杀 虫剂产生 抗药性。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 115141890 A 2022.10.04 CN 115141890 A 1.一种二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)提取单头二化螟基因 组DNA； (2)在反应容器中建立LAMP 反应体系， 包括： 特异性引物、 显色试剂和LAMP 反应液， 并补 充水； (3)将反应容器放入加热器中加热反应； (4)LAMP反应后， 含A282S突变的反应溶液的颜色发生明显变化， 不含A282S突变的反应 液颜色不变。 2.根据权利 要求1所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特征 在于， 步骤(2)中， 所述的特异性引物包括外引物F3和B3以及内引物FIP和BIP， 引物F3和B3 序列分别如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示， 内引物FIP和BIP序列分别如SEQ  ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示。 3.根据权利 要求2所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特征 在于， 外引物终浓度为0.3～0.5 μM， 内引物终浓度为1.5～1.7 μM 。 4.根据权利 要求1所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特征 在于， 步骤(2)中， 所述的显色试剂为羟基萘酚蓝 。 5.根据权利 要求4所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特征 在于， 羟基萘酚蓝的终浓度为140～16 0 μM。 6.根据权利 要求1所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特征 在于， 步骤(2)中， 所述LAMP反应液包括： Bst  DNA聚合酶0.23～0.25U/ μL、 10 ×Thermo Pol  1.4～1.6 μL、 Mg2+ 3～5mM、 dNTP  0.7～0.9mM、 甜菜碱 0.5～0.7M、 DNA模板 0.5～0.7 μL。 7.根据权利 要求1所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特征 在于， 步骤(2)中， 所述的水为无菌纯 水， 用量为补充反应 体系至15 μL。 8.根据专利 要求1所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特征 在于， 步骤(3)中， 所述的加热反应温度为62 ～65℃。 9.根据专利 要求1所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特征 在于， 步骤(3)中， 所述的加热反应时间为5 5～65min。 10.根据权利要求1所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 其特 征在于， 步骤(4)中， 含A282S突变的反应溶液的颜色变化为天蓝色， 不含A282S突变的反应 溶液的颜色为 紫色。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115141890 A 2二化螟GABA受体RD L1亚基A282S突变的分子检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种检测方法， 具体涉及一种二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的 分子检测方法。 背景技术 [0002]二化螟Chilo  suppressalis(Walker)属于鳞翅目螟蛾科， 是水稻上为害最严重的 害虫之一， 在世界范围内均有分布。 二化螟是一种钻蛀型害 虫， 幼虫能够在水稻的不同发育 期钻蛀茎秆为害， 破环植物输导组织， 造成水分和营养流失， 导致水稻大幅减产。 同时它还 危害茭白、 玉米、 高粱、 甘蔗等 植物， 给我国农业 生产造成了严重的损失。 [0003]长期以来， 人们对二化螟的防治主要依赖于化学方法， 然而 随着大量的化学农药 长期、 连续、 不合理的被用于防治二化螟， 导致二化螟对多种杀虫剂产生了不同程度的抗 性， 使得药剂的田间防效降低， 防治成本逐年提高。 有研究表明二化螟已对有机磷类、 苯基 吡唑类和双酰胺类等多种类型的杀虫剂产生了不同程度的抗药性， 并且害 虫对苯基吡唑类 杀虫剂的抗药性与GABA受体RDL亚基A2 ’S位点突变密切相关。 2014年对我国南方7个地区的 二化螟种群进 行了抗药性监测， 发现部 分地区的二化螟种群已对氟虫腈和丁烯氟虫腈等苯 基吡唑类杀 虫剂产生了低至中等水平抗 性。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方 法， 通过确定特异性引物、 反应温度条件、 结果判定标准等三个主要技术环节， 建立二化螟 GABA受体RDL1亚基A 282S突变的更为便捷准确的基因分子检测方法。 [0005]本发明所述的二化螟GABA受体RDL1亚基A282S突变的分子检测方法， 包括以下步 骤： [0006](1)提取单头二化螟基因 组DNA； [0007](2)在反应容器中建立LAMP反应体系， 包括特异性引物、 显色试剂和 LAMP反应液， 并补充水； [0008](3)将反应容器放入加热容器中加热反应； [0009](4)LAMP反应后， 含A282S突变的反应溶液的颜色发生明显变化， 不含A282S突变的 反应溶液颜色不变。 [0010]本发明步骤(1)中提取单头二化螟基因组DNA 是按照本领域的常规方法， 在一些实 施例中， 选择二 化螟幼虫提取基因 组DNA。 [0011]进一步地， 步骤(2)中， 特异性引物包括外引物F3和B3以及内引物FIP和BIP， 所述 内引物FIP/BIP序列分别为： [0012]FIP:AGACCCGAGCAGGAGTTGCTGATTGTAATCATATCATG GGTATC(SEQ  ID NO.1) [0013]BIP:GTTACCACTGTAT TGACTATGACTACGTCGATAGAT TTCACGTAAG(SEQ ID NO.2) [0014]所述外引物F3 /B3序列分别为：说　明　书 1/4 页 3 CN 115141890 A 3