(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210735262.7 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 广西壮族自治区食品药品检验所 地址 530021 广西壮 族自治区南宁市青秀 区青湖路9号 (72)发明人 罗轶　吴桂凡　凌婕　李立　陆游　 罗永强　 (74)专利代理 机构 南宁市来 来专利代理事务所 (普通合伙) 45118 专利代理师 来光业 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方 法及鉴别引物 (57)摘要 本发明公开了一种两面针中伪品飞龙掌血 的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物， 具体包括模 板DNA提取、 PCR扩增反应、 琼脂糖电泳检测、 结果 判定四个步骤； 所述的特异性PCR鉴别引物为： 上 游引物： 5 ´GCTCCCGTCTCTCCGACT  3´； 下游引物： 5 ´TGACGCTTTTCCAGACTACA  3´。 本发明提供的鉴别 方法简单易行， 客观性强， 采用所述方法及鉴别 引物能够快速准确的对两面针和其伪品飞龙掌 血进行鉴别， 从而保证两面针药材的临床疗效和 用药安全， 有利于 两面针药 材市场的健康发展。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图7页 CN 115478115 A 2022.12.16 CN 115478115 A 1.一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别引物， 其特征在于， 该特异性PCR鉴别 引物为： 上游引物： 5 ´GCTCCCGTCTCTC CGACT 3´， 下游引物： 5 ´TGACGCTTTTCCAGACTACA  3´。 2.一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： （1） 模板DNA提取： 取供试品用75%乙醇擦拭表面， 晾干； 用研磨仪磨成极细粉末备用， 称 取干燥供试品约20  mg置1.5 mL离心管中； 使用新型植物组织基因组DNA 提取试剂盒提取样 品的DNA； 同时飞龙掌血 阳性对照模板DNA溶 液， 也按照同样方法进行； （2） PCR反应： 采用权利要求1中所述的特异性PCR鉴别引物： 上游引物： 5 ´GCTCCCGTCTCTC CGACT 3´  ， 下游引物： 5 ´TGACGCTTTTCCAGACTACA  3´； PCR反应体系： 反应总体积为20  μL， 反应体系包括2 ×DNA聚合酶Mix  预混液 10μL， 上 下游引物10 μmol/L  各0.75 μL， 模板DNA  1μL， 无菌水7.5 μL补足； 另取等体积无菌水代替模 板DNA， 作为空白对照； 反应条件： 将离心管置PCR仪， PCR反应参数： 95℃预变性5分钟； 循环反应35次， 95℃变 性30秒， 56℃退火3 0秒， 72℃延伸3 0秒； 72℃延伸5分钟； （3） 琼脂糖电泳检测： 照琼脂糖凝胶电泳法， 配置2%琼脂糖电泳， 胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed,取供试 品、 飞龙掌血阳性对照产物3～5 μl进行上样， DNA分子量标记上样量为2.5 μl， 电泳结束后在 在凝胶成像仪上进行检视；  （4） 结果判定： 供试品凝胶电泳图中， 供试品在200～300bp间不得出现与飞龙掌血对 照药材大小一致的条带， 空白对照无 条带。 3.根据权利要求2所述的两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中使用新型植物组织基因 组DNA提取 试剂盒提取样品的DNA的具体提取步骤如下： ①采用天根高效植物基因组DNA提取试剂盒， 在装有供试品的离心管中加入400  μL缓 冲液LP1， 涡旋震荡混匀， 室温放置10分钟； 加 入130 μL缓冲液LP2， 充分混匀， 涡旋振荡1分 钟； 12,000rpm离心5分钟， 小心将上清转移至新的1.5mL离心管 里； ②加入1.5倍体积的缓冲液LP3， 立即充分震荡混匀15秒； 将上一步所得溶液和絮状沉 淀都加入一个吸附柱CB3中， 吸附柱放入收集管中， 12,000  rpm离心30秒， 倒掉废液， 吸附柱 CB3放入收集管中； 向吸附柱CB3中加入600  μL漂洗液PW， 12,000  rpm离心30秒， 倒 掉废液， 将吸附柱CB3放入收集管中； ③重复上一步漂洗过程； 将吸附柱CB3放回收集管中， 12,000  rpm离心2分钟， 倒掉废 液； 将吸附柱CB3置于室温放置2分钟， 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； 将吸附柱CB3 转入一个干净的1.5mL离心管中， 向吸附膜的中间部位悬空滴加50  μL洗脱缓冲液TB， TB已 预先在金属浴中加热至65℃； 室温放置5分钟， 12,000  rpm离心2分钟， 将溶液收集到离心管 中； ④小心把离心管中所得全部溶液重新悬空滴加至CB3的吸附膜的中间部位， 室温放置5 分钟， 12,0 00 rpm离心2分钟， 将溶 液收集到 离心管中。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115478115 A 2两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方 法及鉴别引物 技术领域 [0001]本发明属于中药材鉴定技术领域， 具体涉及一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性 PCR鉴别方法及鉴别引物。 背景技术 [0002]两面针为芸香科花椒属植物两面针 Zanthoxylum nitidum (Roxb.) D C的干燥根， 具有行气止痛、 活血化瘀、 祛风通络的功效。 用于气滞血瘀引起的跌打损伤、 风湿痹痛、 胃 痛、 牙痛， 毒蛇咬伤； 外治汤火烫伤。 飞龙掌血为芸香科飞龙掌血属植物飞龙掌血 Toddalia asiatica (L.) Lam.的干燥根， 具有散瘀止血， 祛风除湿， 消肿解毒的功效。 根皮： 跌打损 伤， 风湿性关节炎， 肋间神经痛， 胃痛， 月经不调， 痛经， 闭经； 外用治骨折， 外伤出血。 《广西 中药材标准》 1996年版第二册收载了飞龙掌血， 药用部位为根和茎、 云南省中药材标准2005 年版第四册收载为飞龙掌血茎 。 [0003]两面针是我国南方地区常用中药， 由于其药理活性强， 疗效显著， 临床用量日渐增 大。 据文献报道， 由于两面针药材生长周期较长， 需求量逐年增加而野生资源不断减少， 导 致两面针市场混伪现象较严重， 同科植物飞龙掌血是最为常见的两面针伪品。 两面针标准 中含量测定指标为氯化两面针碱， 而伪品飞龙掌血中氯化两面针碱含量较高， 实际生产中 可能存在替代两面针投料生产的情况， 造成临床疗效和用药安全隐患。 因此， 为规范两面针 药材市场和保证两面针药材临床疗效和用药安全， 需要一种简单可靠， 能够准确快速鉴别 两面针中伪品飞龙掌血的方法。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法及鉴别 引物， 该鉴别方法简单易行， 采用所述方法及鉴别引物 能够快速准确的对两面针和 其伪品 飞龙掌血进行鉴别， 从而保证两面针药材 的临床疗效和用药安全， 有利于两面针药材市场 的健康发展。 [0005]为实现上述目的， 本发明采用如下的技 术方案： 一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别引物， 该特异性PCR鉴别引物为： 上 游引物： 5 ´GCTCCCGTCTCTCCGA CT 3´ （SEQ ID NO:1） ； 下游引物： 5 ´TGACGCTTTTCCAGACTA CA 3´ （SEQ ID NO:2） 。 [0006]一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法， 包括以下步骤： （1） 模板DNA提取： 取供试品用75%乙醇擦拭表面， 晾干； 用研磨仪磨成极细粉末备 用， 称取干燥供试品约20 mg置1.5 mL离心管中； 使用新型植物组织基因组DNA提取试剂盒 提取样品的DNA； 同时飞龙掌血 阳性对照模板DNA溶 液， 也按照同样方法进行； （2） PCR反应： 采用所述的特异性PCR鉴别引物： 上游引物： 5 ´GCTCCCGTCTCTC CGACT 3´ （SEQ ID NO:1） ，说　明　书 1/6 页 3 CN 115478115 A 3